中量提取质粒DNA（CsCl 密度梯度离心法）

中量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）2010‐07‐07李渊越1.将菌液倒入装有50mLTB的锥形瓶中，或从培养好的平板上挑取单克隆，锥形瓶置于37℃摇床350rpm培养16-20h,至OD600到10-12。（OD600到40为用TBS培养基在我们的培养条件下所能达到的最高浓度，在此浓度时，菌处于对数生长期）2.将培养好的菌液到入国产50mL离心管中，每管不超过45mL。（有实验表明，若往离心管中装入超过45mL的液体，离心后，液体的终体积仍为45mL。因此，一次不应离超过45mL的液体，否则将污染离心机。）3.室温离心5,000rpm，5min。弃上清，控干。4.加P1-RNase至终体积到7mL，震荡重悬至菌均匀分散。（按该法最多只能裂解45mL13OD的细菌，如需裂解更多细菌，请按比例增加。否则将导致细菌裂解不完全，反而提到更少的菌。）5.加14mLP2，盖上盖子，上下颠倒混匀2min。（该步一定要混匀，以达到将细菌完全裂解的目的。加入P2后可见溶液澄清粘稠，该步反应时间不应过久）6.加7mLP3。（P2和P3之间反应时间不要超过5min。混匀后可见絮状沉淀。该步若置于冰上，沉淀效果更好。但位于室温的反应以足以达到实验需要。）用H2O配平至对称管重量差<0.1g。7.室温（4度更好，但没有必要。）离心，10,000rpm,5min。8.将上清用滤纸过滤至另一国产的50mL管中。加0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀后室温（不可置于4度。若置于4度，将会使部分盐析出）静置10min。（分子克隆p35）9.室温离心10,000rpm15min。10.弃上清，在加1.8mLH2O溶解完全后，平均分至两个1.5mL管中，再分别往每管中加入二分之一体积的PEG8000，4C沉淀2小时。11.3,000rcf离心3min，弃上清。（可以不要非常完全控干）12.加1.55mLCsCl溶液溶解至沉淀完全溶解。10,000rcf3min离心，弃去不溶物质。13.往2mL超速离心管中加入50ul2mg/mLEB。加之前用卷纸把枪头外壁的EB擦干。（将外壁的EB擦干是为了防止EB残留在离心管的管口。）14.将DNA移至2mL超速离心管中,并用H2O将体积补至2mL。（此时，溶液的密度为3.10g/2mL，共含1.55gCsCl。）15.配平至对称管重量差<0.02g，封口。（该步配平时，可按1ulH2O重0.001g来补加H2O进行配平以缩短时间。）在封口后，上下颠倒混匀。16.打开超速离心机，按Memu->Programme->Plasmid-CsCl->OK。（该步为149,000rpm2h升速max降速6。）17.按Vacuum至真空度<400后按Start。（不等真空度至<400其实也可启动，但这可能将造成离心机反复升降速，故制定此规则。）等升至最大转速后才能离开。（该步为离心机安全操作必须，请务必做到。）18.2h后，取出转头，离心管。若转头内有液体需将其洗净，擦干。（因为此时泄漏的液体含有EB，因此需要将其洗净，擦干。）19.先用8号针头在离心管上部插个洞，再用1mL注射器抽出所需的红色DNA条带至1.5mL离心管中。20.加入1mL水饱和正丁醇，上下颠倒混匀（勿用振荡器）约20下。（或更多，使上部液体尽可能变红。）将1.5mL管置于离心机中，按Short键5秒，松手。弃去上层液体。（离心的目的是为了加速液面分层，因此也可省去。）21.重复20步2-3遍，至下层看不到红色后再萃取一遍。（再萃取一遍的目的是为了确保EB完全去除。）22.往溶液中补加等体积的H2O，平均分成若干管，使每管终体积为400ul。往每管中分别加入1mL(2.5倍体积)无水乙醇，颠倒混匀。13,500rpm5min4C。弃上清。（该步的目的是为了除去溶液中残留的CsCl。）23.加1mL预冷的70%乙醇洗一遍。13,500rpm5min4C。弃上清。（该步的目的是为了除去21步中管壁上残留的部分含CsCl的液体。）24.加400ulH2O或TE溶解。（对于高拷贝质粒，45mL菌液将获得500-1,500ug左右质粒。）中量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）2010‐07‐07试剂P150mLP1+5mgRNase，4C保存。P2P3异丙醇PEG8000CsCl溶液准确称取31.00gCsCl，加H2O定容至30.0mL。2mg/mLEB水饱和正丁醇无水乙醇70%乙醇