引物设计和末端标记实验

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

5X激酶缓冲液

0.25mol/LTris-HCl,pH9

0.05mol/LMgCl₂

0.05mol/L二硫苏糖醇（DTT)

0.25mg/ml牛血清白蛋白（BSA)

-20°C储存

灭菌重蒸水（ddH₂0)

TE缓冲液，pH8.0

10mmol/LTris-HCl,pH8.0

1mmol/LEDTA，pH8.0

2.酶和酶缓冲液

聚核苷酸激酶，10U/ul(Roche)

3.核酸和寡核苷酸

寡核苷酸引物

4.放射性化合物

[y^-32P]ATP6000Ci/mmol/L(lCi=3.7X10¹⁰Bq)(PerkinelmerLifesciences)

也可用[y^-33P]ATP,它相对于[y^-32P]ATP危险性稍微小一些，并具有更长的半衰期，但是更贵。

5.离心机和转子

用翻转吊桶式转子离心，15ml锥形管的适配器

6.专用设备

丙烯酸防护板、离心管架（「betablock」）和废弃物容器

离心管架（例如3008-1000fromUsascientific)

收集管（1.5ml，包括快速离心柱）

冷却块（coolingblock)

锥形管，15ml

盖革计数器（Geigercounter,—种放射能测定器）

离心管，0.5ml，灭过菌

QuickSpin柱（TE：),G-25葡聚糖凝胶（Sephadex)柱，用于放射性标记DNA的纯化(Roche)

水浴

二、方法

1.用灭菌ddH₂0将引物稀释至10umol/L。所购买的引物是以50nmol/L等级合成的收到时呈冻干粉状。用PH8.0的TE缓冲液将干粉溶解后，作为储存液保存。使用前将其稀释成10umol/L的工作溶液，分装成小份，冻存于-20°C。

2.选择一个引物进行末端标记。在冰上融化引物和5X激酶缓冲液。酶在加入反应体之前都要放在冰柜里，也可以用台式冷却块使酶维持在-20°C。在室温下融化同位素，需将丙烯酸防护板挡在前面。

3.在冰上将3ul灭菌ddH20、5.6ul5X激酶缓冲液、12ul10mol/L引物和1.4ul聚苷酸激酶加入到灭菌的0.5ml离心管中，将冰盒放在丙烯酸防护板后面，加入6ul[y^-32P]ATP(6000Ci/mmol/L)。混匀，盖上盖子，37°C水浴上温育1~2h。

4.在温育的最后10min准备QuickSpin柱。将柱子反复颠倒混匀，除去管帽和顶盖放入收集管内。将柱子/收集管组件置于15ml锥形管中，在台式离心机中以1100g离心2min。倒干收集管再离心一次。在装入末端标记的反应混合物之前，转移柱到另一干净的收集管中。

5.温育完成之后，将末端标记反应混合物在离心机上短暂离心。加入52ul灭菌ddH₂0,移液器吹打混匀，转移所有溶液到离心柱上纯化（比如除去未利用的核苷酸)。

6.1100g离心4min。

7.从收集管上将柱子取下，并扔入适当的放射性废弃物容器中。盖上收集末端标记物的收集管的盖子。继续PCR方案（方案2)或将引物放在试管架上于-20°C冻存。