模板 DNA 的准备、实验的组织和 PCR 扩增实验

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

含15mmol/LMgCl₂的10XPCR缓冲液(GeneAmpPCR缓冲液I，AppliedBiosystems)

灭过菌的ddH₂0

2.酶和酶缓冲液

TaqDNA聚合酶，(AppliedBiosystems或Invitrogen)

3.核酸和寡核苷酸

基因组DNA

10mmol/LdNTP(GeneAmpPCRdNTP混合物，AppliedBiosystems)

寡核苷酸引物（Invitrogen公司合成，稀释成lOumol/L)

4.离心机和转子

用翻转吊桶式转子和微板适配器离心

5.专用设备

丙烯酸防护板（acrylicshield)

过滤阻挡吸头（filterbarriertips)

多道移液器（Eppendorf或ApogentDiscoveries)

PCR仪，96孔（AppliedBiosystemsGeneAmp9700)

托盘/固定器装置和底座，96孔（AppliedBiosystems)

管盖，一条8个（USAScientific或AppliedBiosystems)

小管，0.2ml，一条8个（USAScientific或AppliedBiosystems)

二、方法

1.在冰上融化dNTP、10XPCR缓冲液和未标记的引物。Taq酶在加入反应混合物之前应保存在-20°C。在丙烯酸防护板后融化标记的引物。

2.每一个反应的混合物包括：

灭菌ddH₂0                            6.95ul

含MgCl₂的10XPCR缓冲液           1.25ul

10mmol/LdNTP                               0.25ul

10mmol/L未标记引物            0.5ul

标记引物                                           0.5ul

在优化实验条件过程中，如果PCR产物的放射信号强度太低，可以增加标记引物的用量，同时按相应

比例调整ddH₂0的体积。

TaqDNA聚合酶（终浓度为0.25U)    0.05ul

对于一个96孔微孔板，准备用于100个反应的混合物。

3.混匀，按等份加入放置在冰上的PCR板中（9.5ul/样品）。

4.用多道移液器加入3ulDNA(60ng)，混匀。

5.把盖子盖紧，将板放入预热到94°C的PCR仪中。

6.如果产物大小是200bp,扩增30个循环。循环参数如下：94°C初始变性5min;30个循环的94°C变性30s;根据经验确定的退火温度（Tm)退火30s;72°C延伸30s。最后一步72°C延伸7min。值可以通过引物序列计算出来，公式为2(A+T)+4(G+C)。

7.扩增完成后，将样品于-20°C冻存，或者直接进入方案3。