地高辛检测方法

地高辛检测试剂盒 DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I

货号: 11745832910

罗氏科学应用部（Roche Applied Science）是最早致力于向用户提供非放射标记技术的公司之一，让更多的科研工作者们可以避免使用危险的放射性同位素。自1995年罗氏专利的地高辛产品上市以来，尽管陆续有许多出色的竞争者涉足这一领域，尽管有定量PCR技术的应用，DIG系统仍然是非放射性高效标记—检测技术的首选，被广泛地应用各种膜杂交及原位杂交技术中。

技术原理：

地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇（Steroid）物质—— Digoxigenin （DIG），在医学上可用于治疗各种急性和慢性心功能不全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动等疾病。由于洋地黄植物的花和叶片Digoxigenin在自然界中的唯一来源，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。这一点，正是DIG胜于生物素(Biotin)的地方——同样是小分子标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个问题。

技术特点：

与放射性标记和检测技术相比较，DIG 系统具有一下多个优势：

è高灵敏度，完全可满足实验需要，某些方面甚至可与放射性标记的灵敏度向媲美

è曝光时间短，结果显示时间以分钟计算，无需几小时甚至几天的自显影过程

è安全环保，不接触放射性物质，不会对环境造成污染

è探针可重复使用，最少可以稳定储存一年

è可轻松进行探针拨离和重探

è凭借多年的经验和众多使用者的反馈意见，提供全面的应用指南

应用领域：

地高辛系统能够安全高效地标记DNA, RNA或是寡聚核苷酸探针，这些探针可以被广泛地应用在

èSouthern blotting, dot blotting

èNorthern blotting

èArray

èColony hybridization

èIn situ hybridization

èELISA

技术细节：

DIG 通过一个含有11个碳原子的空间臂与尿嘧啶核苷酸上的C5位置相连，一定浓度的DIG标记的核苷酸可以通过DNA polymerase(如E.coli DNA Polymerase, T4 DNA Polymerase, T7 DNA Polymerase, Reverse Transcriptase, Taq DNA Polymerase ）、RNA polymerase (如SP6, T3或T7 RNA Polymerase)或是末端转移酶（Terminal Transferase）的作用掺入到核苷酸探针中；也可通过随即引物标记（random primed labeling）, 缺口平移（nick translation），PCR，3’端标记/加尾或是体外转录制备带有DIG标记的探针。当然也可以通过化学合成的方法进行核苷酸的标记。

Fig. Structure of Alkali-liable Digoxigenin(DIG)-dUTP

对于DIG 标记探针的杂交检测，可选用连接有碱性磷酸酶（alkaline phosphatase），过氧化物酶(peroxidase),荧光素（fluorescein）,若丹明（rhodamine）或是胶体金（colloidal gold）高亲和性的抗DIG抗体共轭物；也可选用不带任何共轭连接的抗DIG抗体和二级抗体。

检测的灵敏度主要依赖于对不同抗DIG抗体共轭物显示方法的选择。以连接有碱性磷酸酶的抗DIG 抗体为例：即可以使用NBT或BCIP做底物的显色法，也可以使用HNPP荧光碱性磷酸酶底物，检测的灵敏度常规可达到0.1pg (Souther blot)。