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【求助】PBMC CD8 CD25染不上,染了几个月了一直染不好,都快崩溃了。

一、第一次还可以染上,但是之后再也染不上了,这是何故?
我的步骤:
1.收集PBMC,1200r,5min;
2.PBS洗涤2次,1200r,5min每次;
3.staining buffer 100ul,CD4(FITC),CD8(647)或CD25(RPE)各5ul每孔,室温避光孵育30min;
4.重复2;
5.staining buffer 300ul,上机检测。
二、胞内染色,我的il-4(pe)和IFN-garmma(647)一直染不上,il-17(cyc5.5)和foxp3(647)非特异性染色很高,可达90%以上,有的分群还是很明显,有的不行。
我是cd4,il4,IFN-garmma和il-17一起染,测th1/th2/th17; CD4,CD25和foxp3一起染测treg细胞。
我的胞内染色步骤是:1.胞面染色后,破膜室温避光40min(破膜是可以破胞膜和核膜的),0.5ml/孔;2.破膜buffer洗涤2次,1ml/孔;3.加相应抗体,一般5-8ul每孔,室温避光孵育30min;4.破膜buffer洗涤2次,1ml/孔;5. staing buffer 300ul,上机检测。
三、试剂品牌
抗体:1.CD8(647)CD25(RPE) IFN-garmma(647)il-4(pe)都是 AbD serotec的;
il-17(cyc5.5)是kingfisher biotech的,另外加的染料(innova Biosciences的)。
破膜剂:用的eBioscience的foxp3/transcription Factor staining buffer set. fixation/permeabilization和稀释液用1:3. 破胞膜和核膜全用她。
没有人理我我就放弃了,实在是做不出来啊。
先跪谢了!

胞外染色一般不会出问题啊,你流式仪激光开关没忘记打开吧?有的流式仪开机时要开上盖,检测的时候别忘了关上盖。胞内染色我刚开始用的invitrogen的固定破膜套装,效果也不好,后来自己配的4%多聚甲醛固定,0.2%的triton-x破膜就很好,我也一直不知道原因

不能放弃,没准下一回就能得到想要的结果呢!这只是黎明前的黑暗。分析一下用的抗体浓度,抗体对不对(有专门抗牛的抗体吗)有时是需要冷静下来好好想想的!加油 !

热爱医学的小猪 不能放弃,没准下一回就能得到想要的结果呢!这只是黎明前的黑暗。分析一下用的抗体浓度,抗体对不对(有专门抗牛的抗体吗)有时是需要冷静下来好好想想的!加油 ! 我用的是专门抗牛的单抗。


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