动物麻醉机的组成

SuperFcs条件性恐惧实验方法案例以及注意事项

----毛冬青改善血管性痴呆小鼠学习记忆作用的研究

摘要：目的观察毛冬青提取物（pubescenthollyrootextract，PHRE）对血管性痴呆（VD）模型小鼠学习记忆能力的影响，探讨其潜在的作用机制。方法采用反复夹闭、再通双侧颈总动脉同时尾静脉放血的方法制备小鼠痴呆模型，随后将小鼠随机分为假手术组，模型组，尼莫地平对照组（30mg·kg-1），毛冬青低、中、高剂量组（5，10，20g·kg-1），各组灌胃相应**10mL·kg-1，连续35d，从第30天开始进行行为学检测，末次给药后收集大脑样本，HE染色观察病理学变化、**组化法及WesternBlot法检测Bcl-2、Bax蛋白表达。结果与假手术组比较，模型组小鼠的恐惧记忆时间明显缩短，大脑海马区神经元细胞病变严重，海马区Bcl-2/Bax蛋白表达的比值降低，且主要分布于胞质。与模型组比较，各**组小鼠的恐惧记忆时间明显延长，大脑海马区的组织病变情况改善，且海马区Bcl-2/Bax蛋白表达的比值显著增加。结论毛冬青提取物可能通过上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，减少细胞凋亡，保护神经细胞，从而改善血管性痴呆小鼠的学习记忆功能。

关键词：毛冬青提取物；血管性痴呆；学习记忆能力；细胞凋亡

随着全球老龄化的出现，慢性**痴呆越来越引起人们的关注。其中，血管性痴呆（vasculardementia，VD）是继阿尔茨海默病（Alzheimerdisease，AD）之后诱发老年期痴呆的第二大病因，也是目前唯壹可以预防的脑退化**类型。因此，研发有效预防及**VD的**具有重要的意义。毛冬青为冬青科冬青属植物毛冬青（IlexpubescensHook.etArn）的干燥根或叶，是我国南方常用中药，具有****、消肿止痛、****等功效，大量研究表明，毛冬青的各类制剂对冠心病、脑血栓、血栓性脉管炎等心脑血管**均有显著疗效。本研究通过观察毛冬青提取物（pubescenthollyrootextract，PHRE）对血管性痴呆小鼠学习记忆、海马区病理变化及凋亡相关蛋白表达的影响，探讨毛冬青改善血管性痴呆学习记忆的可能作用机制，为中医药防治VD提供实验依据。

1材料与方法

1.1动物KM种小鼠，雄性，SPF级，体质量32～35g，由广东省实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（粤）2013-0002。实验动物喂养环境：温度23～25℃；相对湿度（50±5）%，常规饲料饲养。1.2**及主要试剂毛冬青饮片分别购于康美药业股份有限公司和广州大翔药业有限公司，经广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波教授鉴定为毛冬青植物IlexpubescensHook.et.Arn.。取毛冬青饮片300g，粉碎成粗粉，加入60%乙醇加热回流提取2次，依次用6倍量和4倍量溶媒分别提取1.5h和1h，滤过后合并药液，减压浓缩至150mL，即得PHRE储备液，用时以蒸馏水稀释至所需浓度。

尼莫地平片，拜耳医药保健有限公司，批号：BJ24208。SABC**组化染色试剂盒，博士德生物，批号：11C29C。β-actin抗体，bioworld，批号：AP0060。Bcl-2抗体，abcam，批号：ab182858。Bax抗体，abcam，批号：ab32503。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：IH-0011。

1.3仪器AUM220D电子分析天平，日本Shimadzu公司；超低温冰箱，美国Thermo公司；制冰机，日本Sanyo公司产品；高速冷冻离心机，中国中科中佳科技仪器有限公司；多功能酶标仪，美国PerkinElmer公司；CM1950冰冻切片机，ASP200S脱水机，EG1160包埋机，RM2135切片机，ST5020染色机，DC300光学显微镜，均为德国Leica公司；小鼠条件恐惧试箱、XR-XC404条件性恐惧分析系统，上海欣软科技有限公司。

1.4分组、模型制备及给药取雄性KM种小鼠，采用颈总动脉结扎反复缺血再灌注的方法[5]制备经典VD模型：小鼠腹腔注射3.5%水合氯醛（10mL·kg-1）全身麻醉，分离双侧颈总动脉，用动脉夹阻断其血流30min，松开动脉夹恢复血流10min，重复3次。于第1次阻断血流5min后，小鼠断尾放血约0.3mL，冷凝止血。第3次血流再灌注后30min，观察小鼠呼吸、心跳，待其正常后即可缝合皮肤。假手术组小鼠仅暴露双侧颈总动脉同等时间即可缝合皮肤。造模后第2天，除假手术组外，将模型小鼠随机分为5组，分别为模型组，尼莫地平对照组（30mg·kg-1），PHRE低、中、高剂量组（含生药量5，10，20g·kg-1），每组12只。各组小鼠按10mL·kg-1灌胃给药，连续35d，每天1次，假手术组及模型组灌胃等体积的蒸馏水。

1.5行为学检测

1.5.1爬杆实验第30天给药后2h，进行爬杆实验测试。将一根长50cm、粗1.5cm的竹竿固定在泡沫盒上，竹竿用纱布包裹以防打滑，小鼠头朝下放置于竹竿顶部，记录小鼠爬完杆长全长所需时间。正式记录评分之前，训练小鼠爬杆3d，每日1次，确保每只小鼠学会爬杆。根据爬杆时间进行评分，若小鼠坠落评7分，不动评6分，40s掉头评5分，20s掉头评4分，爬完全长31～40s者评3分，21～30s者评2分，11～20s者评1分，0～11s者评0分。

1.5.2条件恐惧实验给药34d后进行条件恐惧实验，实验分为两个阶段，**阶段为恐惧训练阶段，即第34天给药2h后，将小鼠放入恐惧箱中，从20s开始给予声刺激（75dB，2000Hz），持续10s，从25s开始给予光刺激，持续5s，从28s开始足部电刺激（0.8mA）2s。共进行4个循环，间隔时间各为15s。第二阶段为测试阶段，即第35天给药2h后，将小鼠放入恐惧箱中，场景与受训阶段场景一致，提供相同的声、光等提示性信号，但不给予电击，动物仍将会表现出恐惧反应，通过观察动物的僵直时间来反映动物对恐惧的记忆能力。

1.6样本采集恐惧实验结束2h后，每组随机选取6只小鼠，腹腔注射3.5%水合氯醛（10mL·kg-1）麻醉，通过心脏灌注4%多聚甲醛固定脑组织，灌注完成后，取脑组织置于10%中性福尔马林溶液中固定，用于病理切片制作。其余小鼠断头处死，迅速摘取大脑，分离海马区，用于**组化及WesternBlot检测。

1.7HE染色观察固定好的脑组织经修整、脱水、包埋、切片、HE染色、封片等程序后，使用光学显微镜观察小鼠海马组织CA1区组织结构的变化。1.8**组化检测Bcl-2、Bax蛋白的分布及表达用TissueOCT-FreezeMedium包埋小鼠大脑并制作冰冻切片。严格按照SABC**组化染色试剂盒说明依次固定、封闭、一抗孵育、二抗孵育、SABC孵育、DAB显色、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜观察，并用数码医学图像分析系统进行数码照相及图片分析Bcl-2、Bax蛋白的分布及表达情况。

1.9WesternBlot法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达分离小鼠大脑海马区组织，提取总蛋白，BCA试剂盒进行定量。取50μg蛋白样本，用15%的聚丙烯酰氨凝胶进行电泳80V、20min，之后转换为120V、80min；然后采用湿转法进行转膜300mA、1h；TBST洗膜10min，3次；5%BSA常温封闭4h；4℃孵育一抗过夜；TBST洗膜10min，3次；37℃孵育二抗1h；TBST洗膜10min，3次；ECL进行发光，用ImageLab3.0软件对WesternBlot成像图进行分析，计算各组蛋白与内参（β-actin）的相对表达值。1.10统计学处理方法采用SPSS17.0软件进行统计分析，数据以“x±s”表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性者使用LSD检验；方差不齐者使用Dunnett’s检验。

2结果

2.1各组小鼠爬杆评分比较爬杆实验用于评价各组间小鼠肢体协调能力的差异。评分结果显示：假手术组、模型组及各给药组间均无明显差异（P＞0.05），表明本研究采用的VD造模方法对小鼠的运动及平衡能力没有造成影响。

2.2PHRE对小鼠条件恐惧记忆的影响与假手术组比较，模型组小鼠的僵直时间百分比显著缩短（P＜0.05），表明VD模型复制成功，小鼠的记忆能力下降。与模型组比较，尼莫地平组及PHRE中、高剂量组小鼠的僵直时间百分比明显延长，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明PHRE在10~20g·kg-1范围内对VD小鼠的记忆能力有明显的改善作用。

2.3毛冬青提取物对VD小鼠大脑神经元细胞形态的影响病理组织学检查显示，假手术组小鼠大脑皮层和海马区神经细胞的形态及分布未见异常。与假手术组比较，模型组小鼠神经细胞间质水肿，细胞核浓染、固缩，皮层神经细胞明显减少，且伴有大量胶质细胞增生，多处聚集成堆，大脑海马CA1区的锥体细胞大量缺失、变性、坏死，齿状回颗粒细胞变性成空泡样。与模型组比较，PHRE低、中、高剂量组和尼莫地平组小鼠的大脑神经元病变情况有明显改善，体现为胶质细胞增生减少，海马CA1区锥体细胞病变程度明显减轻。

2.4**组化法检测VD小鼠海马CA1区凋亡蛋白Bcl-2、Bax的分布和表达结果显示，Bcl-2和Bax呈不连续的环状或者片状分布，主要在胞质表达。与假手术组比较，模型组的Bcl-2和Bax蛋白表达明显增加。与模型组比较，尼莫地平组及PHRE中、高剂量组的Bcl-2表达增加，Bax表达减少。表明VD模型小鼠的海马CA1区神经元细胞发生凋亡，而在尼莫地平或PHRE的干预下，凋亡现象减少，提示毛冬青提取物可以减少VD模型小鼠的海马CA1区神经元凋亡的发生。

2.5WesternBlot法检测VD小鼠海马区Bcl-2、Bax蛋白的表达Bcl-2水平的升高和Bax蛋白的降低表明细胞对凋亡的抵抗性增强，是**起保护作用的标志。Bcl-2/Bax的比值越大，则抗凋亡能力越强。结果显示，与模型组比较，毛冬青提取物能提高VD小鼠海马区Bcl-2蛋白的表达水平，同时降低Bax蛋白的表达，即明显升高Bcl-2/Bax的比值，表明毛冬青提取物可以提高VD小鼠海马区细胞的抗凋亡能力，从而对VD小鼠海马区的神经元起保护作用。

3讨论

本研究通过血流阻断联合放血法复制小鼠VD模型，经过小鼠智能测试及病理学检查证实模型制备成功。实验结果表明，VD模型组小鼠恐惧记忆时间缩短，且脑部海马CA1区神经元发生损伤，而毛冬青提取物能够明显提高VD小鼠的恐惧记忆时间，降低VD小鼠神经元细胞损伤的程度，结合其对凋亡蛋白Bcl-2/Bax的影响可以推断，毛冬青通过抑制海马CA1区的细胞凋亡而发挥神经保护作用。

大脑海马区损伤会引起血管性痴呆，从而导致认知功能障碍。海马体与大脑记忆有关，并且对脑缺血敏感[10]。大量实验结果表明海马CA1区椎体神经元细胞的死亡会引起啮齿类、灵长类动物以及人类出现认知功能障碍[11-12]。因此，海马CA1区锥体细胞对学习和记忆能力至关重要，然而CA1区对脑缺血尤为敏感，会引起严重的学习和记忆功能退化。病理实验结果表明，VD模型组小鼠的大脑海马CA1区锥体细胞大量缺失、变性、坏死，并且齿状回颗粒细胞变性成空泡样。毛冬青提取物可阻止CA1区锥体细胞缺失，从而起到保护海马区神经细胞，改善VD小鼠学习记忆的作用。

细胞凋亡在缺血再灌注损伤中具有重要的作用。Bcl-2和Bax属于Bcl-2家族蛋白，调控细胞凋亡。Bcl-2属于抑凋亡蛋白，可以阻止细胞色素C从线粒体释放到胞浆。Bax属于促凋亡蛋白，通过移位到线粒体膜上促进细胞凋亡，促进细胞色素C的释放。Bcl-2通过平衡Bcl-2/Bax维持线粒体结构稳定。结果表明，与假手术组比较，模型组小鼠海马区Bcl-2与Bax蛋白表达均有所升高，可能为小鼠大脑间断缺血后，促凋亡蛋白Bax表达增加，诱导细胞凋亡，同时由于细胞自身的保护机制，抗凋亡蛋白Bcl-2表达反应性上调，发挥抑制凋亡的作用。由于Bcl-2/Bax的比例决定细胞在受到凋亡信号刺激后是否发生凋亡，在VD小鼠模型中，Bax蛋白的表达占优势，从而导致海马区神经元细胞凋亡，海马区形态受损，记忆力出现障碍；与模型组比较，毛冬青提取物能够提高Bcl-2的表达，降低Bax的表达，从而显著提高Bcl-2/Bax的比值，使海马CA1区细胞的凋亡受到抑制。因此，毛冬青提取物可以通过调节海马CA1区Bcl-2、Bax的表达，抑制CA1区的细胞凋亡，从而改善VD模型小鼠的学习记忆能力。

毛冬青已被广泛应用于心血管系统**的**，疗效确切。近年来，也有学者深入探讨毛冬青对脑损伤的保护作用[14]。本实验结果表明，毛冬青提取物在高剂量时，改善VD小鼠学习记忆障碍的效果与尼莫地平相似，可通过抑制VD模型小鼠的脑组织海马区细胞凋亡来提高学习记忆能力，有望发展成为一种新的**血管性痴呆**。