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| 实验方法原理 | 本方案是Kupiec等所述方法（1987)的改良版本，包括用蛋白酶K消化细胞和组织，用高浓度甲酰胺分离DNA-蛋白质复合物（染色质用火棉胶袋充分透析去除蛋白酶和有机溶剂等过程。甲酰胺是一种离子化溶剂，能分离蛋白质-DNA复合物并使蛋白变性和释放，但他并不明显影响蛋白酶K的活性。用本程序制备的基因组DNA很大7200kb，适于用高包装容量载体构建文库及通过脉冲凝胶电泳分析大片段DNA。本方法有两个缺点：比其他方法需要更多的时间；所制备DNA的最终浓度颇低（约10μg/ml)。从1X108培养的非整倍体哺乳类细胞（如HeLa细胞）中大约可制备1mg高分子质量DNA。 | ||||||
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| 实验材料 | λ噬菌体的线性单体和多联体哺乳类细胞新鲜组织血样 试剂、试剂盒 | 透析缓冲液甲酰胺变性缓冲液TE 仪器、耗材 | 脉冲电场凝胶或0.6%琼脂糖凝胶带有不锈钢杯的搅拌器火棉胶袋尖头去除的黄色尖头透析管夹玻璃棒水浴或孵箱
实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 透析缓冲液1（20mmol/LTris-Cl(pH8.0)，0.1moI/LNaCl，10mmol/LEDTA(pH8.0)，制备6L透析缓冲液1，储于4℃。） 透析缓冲液2（10mmol/LTris-Cl(pH8.0)，10mmol/LNaCl，0.5mmol/LEDTA(pH8.0)，制备6L透析缓冲液2，储于4℃。） 甲酰胺变性缓冲液（20mmol/LTris-Cl(pH8.0)，0.8mol/LNaCI，80%(V/V)甲酰胺） TE(pH8.0) 2.凝胶 脉冲电场凝胶或0.6%琼脂糖凝胶 3.核酸和寡核苷酸 λ噬菌体的线性单体和多联体 4.专用设备 带有不锈钢杯的搅拌器（用于组织） 火棉胶袋 尖头去除的黄色尖头 透析管夹 玻璃棒 预置于15℃的水浴或孵箱 预罝于50℃的水浴 5.细胞和组织 单层或悬浮培养的哺乳类细胞，或新鲜组织，或血样 二、方法 1.采用方案1步骤1~4制备细胞悬液（或冰冻细胞粉末）的裂解液。 2.将含有裂解细胞和裂解缓冲液的溶液冷却至15℃。每1ml细胞裂解液加1.25ml甲酰胺变性缓冲液，用玻璃棒温和地混匀溶液。将溶液在15℃放置12h。 3.将黏滞的溶液灌入一个或者多个火棉胶袋中。透析袋开口用透析管夹封住，在4℃于2L裂解缓冲液1中透析45min。换新鲜缓冲液1并继续透析至少4h后，再换2L新鲜透析缓冲液1透析另外4h。将DNA在2L新鲜透析缓冲液2中透析3次，每次至少4h。 4.测定DNA的浓度。 5.脉冲凝胶电泳或者常规的0.6%琼脂糖凝胶电泳。用λDNA单体或者线性多联体作为分子质量标记。基因组DNA大小将超过200kb。  新闻动态
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