AFLP实验 其它资料 蚂蚁淘在线 LabonWeb

基因组DNA经过二种酶不同的限制性内切酶酶切后，产生粘性末端，再使用连接酶将人工合成的双链接头连接在酶切位点的粘性末端。接头一端具有与内切酶同样的识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板进行预扩增。接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。引物由3部分组成:①核心碱基序列，该碱基序列与人工接头互补；②特异性酶切序列；③引物3端选择性碱基。选择性碱基延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。另外，通过选择在末端分别添加了1～3个选择性核苷酸的不同引物，可以达到选择扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物选择性地识别具有特异配对序列的内切酶酶切片段。并与之结合，实现特异性扩增。

实验材料

基因组DNA提取试剂盒；EcoRI酶（或PstI酶）,MseI酶，T4连接酶试剂盒；Taq酶，dNTP,PCRreactionbuffer；AFLP引物；凝胶电泳所需试剂。

PCR仪，水平电泳和垂直电泳，银染试剂，凝胶成像系统。

银染试剂：

固定液：1%体积比的冰醋酸溶液。

染色液：1gAgNO3，1.5ml37%甲醛，加ddH2O定容至1L。

显色液：30gNa2CO3，1.5ml37%甲醛，2mg硫代硫酸钠，加ddH2O定容至1L。

实验过程

一、基因组DNA提取

用基因组DNA提取试剂盒提取细胞基因组，通过凝胶电泳和分光光度计检测DNA的浓度和纯度。DNA可用纯化试剂盒以提高纯度，方便后续实验进行。实验所需的基因组DNA约100ng左右。

二、酶切处理

1、EcoRI酶切20L酶切体系

Step1预变性以后，step2-step4重复20个循环，然后进入step5延伸。

5、选择性扩增20ul扩增体系

step2-step4重复10个循环，每个循环退火温度下降1℃；然后进入step5-step7，重复20个循环.

6、电泳验证及染色

①电泳完毕后，把凝胶从夹板中取出，为避免凝胶破损，可将凝胶放在玻璃板上，然后放入用于染色的塑料盘中。

②固定：加入固定液，在摇床上轻微震荡30min。固定液可收集用于后续步骤

③加入ddH2O漂洗3次，每次2min。

④染色：将凝胶放入染色盘中，倒入4℃预冷的染色液，在摇床上轻微震荡30min。用ddH2O漂洗凝胶10s后，置入显色盘中。

⑤显色：加入4℃预冷的显色液，在摇床上轻微震荡，注意观察，当凝胶中的条带数不再增加为止。

⑥终止：加入②步骤用后的固定液，轻微震动漂洗数分钟。凝胶中的条带比较清晰后，用蒸馏水漂洗。

⑦去除凝胶和玻璃板上的水珠后，在凝胶成像系统中拍照。

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