基于血浆外泌体核酸的液体活检更适合肿瘤动态监测

基于血浆外泌体核酸的液体活检更适合肿瘤动态监测
Liquidbiopsiesusingplasmaexosomalnucleicnucleciacidsandplasmacell-freeDNAcomparedwithclinicaloutcomesofPatientswithadvancedcancers
 
　目前，医生通过手术或穿刺针取出肿瘤样本，在显微镜下检查并进行遗传学分析，从而做出诊断指导治疗。这种是传统意义上的组织活检。然而由于这种方法具有侵入性的，通常只适用于肿瘤足够大或已威胁到生命的情况。更糟的是，癌症扩散时常常发生突变，意味着原位肿瘤组织活检可能无法帮助治疗侵入性转移的瘤体。液体活检的出现，很好的弥补了组织活检的劣势。基于血液的液体活检提供了更加方便的监测癌症基因组变化的技术。通常，液体活检常用血浆来源的无细胞DNA（cell-freeDNA,cfDNA），然而，cfDNA多起源于发生凋亡或坏死的细胞，不能反映肿瘤活细胞的群体状态。相比之下，外泌体核酸（exosomalnucleicacids,exoNA）来源于活细胞，可以更好地反映潜在的癌症发生发展。
  2017年10月19日，Clinicalcancerresearch在线发表的“Liquidbiopsiesusingplasmaexosomalnucleicnucleciacidsandplasmacell-freeDNAcomparedwithclinicaloutcomesofPatientswithadvancedcancers”中，研究人员采用二代测序方法检测外泌体核酸中的明星肿瘤突变基因BRAF,EGFR和KRAS，并与采用微滴式数字PCR（ddPCR）和BEAMingPCR检测的血浆cfDNA中的BRAF,EGFR和KRAS突变进行比较，最后将实验结果与档案里的肿瘤组织临床检查和临床结果数据进行了比较，发现外泌体核酸突变检测具有更高的特异性及灵敏性，具有更高的临床应用价值。外泌体核酸的低突变频率是长生存期的一个独立预后因素。
 研究共收集了43例癌症患者，包括20例结直肠癌患者，8例黑色素瘤患者和6例非小细胞癌患者以及数量不等的卵巢癌，甲状腺癌以及子宫内膜癌等。采用二代测序方法在20例含BRAF^V600突变基因的癌症患者的外泌体核酸中成功检出19例突变，KRAS^G12/G13突变在17例患者中全部检出，在4例含EGFR^{exon19del/L858R}突变患者中成功检出其中3例。二代测序方法合计检出41例突变中的39例，总体敏感性为95%,且没有出现假阴性情况。DdRCR方法检测癌症患者的无细胞DNA合计检出39例突变中的36例突变，总体敏感性为92%，且出现3例假阴性情况。BEAMing方法检测癌症患者血浆无细胞DNA合计检出35例突变中的34例，总体敏感性为95%，仅出现1例假阴性情况。
表1使用微滴式数字PCR或BEAMing数字PCR，二代测序等方法检测血浆外泌体核酸和无细胞DNA中BRAF，KRAS和EGFR突变的敏感性和特异性。

Method	Mutations	Sensitivity%(95%confidenceinterval)	Specificity%(95%confidenceinterval)
NGSofexoNA	BRAFV600	95%(75%-100%)	100%(85%-100%)
	KRASG12/G13	100%(80%-100%)	100%(87%-100%)
	EGFRexon19del/L858R	75%(19%-99%)	100%(91%-100%)
DropletdigitalPCRofcfDNA	BRAFV600	89%(67%-99%)	100%(85%-100%)
	KRASG12/G13	95%(80%-100%)	96%(79%-100%)
	EGFRexon19del/L858R	67%(9%-99%)	100%(90%-100%)
BEAMingdigitalPCRofcfDNA	BRAFV600	93%(66%-100%)	96%(78%-100%)
	KRASG12/G13	100%(80%-100%)	85%(62%-97%)
	EGFRexon19del/L858R	100%(40%-100%)	100%(88%-100%)

 
研究人员分析了三种方法检测基因突变频率与患者生存率的关系，发现三种方法检测出的突变频率均能显著区分生存期长及生存期短的患者。进一步地，研究人员结合RMH预后评分采用多协变量COX回归分析来分析外泌体核酸和无细胞DNA的突变频率对总生存期的预测作用，发现仅有二代测序检测外泌体核酸的MAF≤4.22%这一指标能够预测总体生存期。

图1三种方法检测KRAS,BRAF或EGFR基因突变频率对总体生存期的预测作用。A.21例外泌体核酸低突变频率（MAF）的患者生存期显著长于22例高MAF患者；B.21例ddPCR方法检测无细胞DNA的低MAF的患者生存期显著长于20例高MAF患者；C.19例BEAMing方法检测无细胞DNA低MAF患者生存期显著长于19例高MAF患者。
 
接着，研究人员分析了32例接受系统治疗患者的治疗失败周期（timetotreatmentfailure,TTF）与三种方法检测突变基因频率的关系，发现三种方法检测的突变频率高低均能显著区分治疗失败时间的长短。

图2KRAS,BRAF或EGFR突变与TTF的关系。
 
最后，研究人员分析了三种方法检测的突变频率与治疗应答的关系，发现外泌体核酸在12例部分响应和病情稳定（stabledisease,SD）≥6个月患者的突变频率显著低于20例疾病进展或SD<6个月的患者。然而，ddPCR及BRAMing两种方法检测无细胞DNA的基因突变频率在部分响应和SD≥6个月患者及疾病进展或SD<6个月的患者中均不存在显著差异。

图3KRAS，BRAF，或EGFR突变频率与疾病治疗响应的关系。
 
综上，研究人员认为血浆外泌体核酸的分子检测在癌症分子诊断中具有重要的潜在应用价值且能预测临床结果。