用于表达分析的 mRNA 的制备实验一备择方案 cDNA 和体外转录产物的固相可逆固定（SPRI）纯化

1.实验前准备

1.1材料

待纯化样品：cDNA（见基本方案步骤11）或体外转录的RNA（见基本方案步骤19）

1.2试剂

羧基端包埋的磁珠（cDNA纯化：PerSeptiveBioSystem；体外转录纯化：BangsLaboratories）

0.5mol/LEDTA

3.5mol/LNaCl/20％（m/V）PEG8000（分子生物学级；无RNA酶）

70％（V/V）乙醇于无RNA酶的水

10mmol/LTrisacetate，pH7.8（无RNA酶）

1.3耗材

磁力架（CPG）

2.纯化cDNA：

2.1每150ulcDNA反应液取10ul磁珠（Perseptive），将所需磁珠放.入同一个微量离心管。

2.2把这个离心管放到磁力架上，让磁珠沉到一侧管壁。用枪小心地吸走上清。

2.3加入与起始磁珠体积相等的0.5mol/LEDTA，轻轻摇振重悬磁珠。再次把管子放到磁力架上，待磁珠分离后，吸去上清。再重复此洗涤步骤两次。

2.4用与起始磁珠体积相等的0.5mol/LEDTA重悬磁珠。

2.5每管cDNA加.入150ul3.5mol/LNaCl/20％PEG8000和10ul磁珠，轻轻摇振或涡旋混匀。室温下放置10min。

2.6把离心管放到磁力架上，让磁珠沉到一侧管壁（第一次约2min，洗涤时可以快点）。

2.7弃去上清，用150ul70％乙醇洗涤两次。最后一步尽量吸干乙醇，晾干2min。

2.8加入25ul10mmol/LTris-acetate（pH7.8），室温放置5min洗脱DNA。

2.9把离心管放到磁力架上，吸取并保存上清。

2.10通过PicoGreen的荧光测定cDNA的浓度。

3.纯化体外转录的RNA：

3.1每60ul体外转录反应液取20ul磁珠（BangsLaboratories），将所需体积磁珠放进同一个微量离心管。

3.2把这个离心管放到磁力架上，让磁珠沉到管壁一侧。用枪小心地吸走上清。

3.3加入与起始磁珠体积相等的0.5mol/LEDTA，轻轻摇振重悬磁珠。再次把管子放到磁力架上，待磁珠分离后，吸去上清。再重复此洗涤步骤两次。

3.4用与起始磁珠体积相等的2.25mol/LNaCl/10％PEG重悬磁珠。

3.5每管体外转录反应液加入60ul3.5mol/LNaCl/20％PEG8000和20ul磁珠，轻轻摇振或涡旋混匀。室温下放置10min。

3.6把离心管放到磁力架上，让磁珠沉到管壁一侧（第一次约2mim洗涤时可以快点）。

3.7弃去上清，用150ul70％乙醇洗涤两次。最后一步尽量吸干乙醇，晾干3min。

3.8加入25ul10mmol/LTris-acetate（pH7.8），室温放置5min洗脱RNA。

3.9把离心管放到磁力架上，吸取并保存上清。

3.10测定260nm的吸收值，定量RNA浓度。