Northern杂交试验指导手册

Northern杂交试验指导手册DIG标记的Northern杂交试验指导一、RNA提取方法一、改良异硫氰酸胍提取法试剂及其配制异硫氰酸胍变性液：贮存液－在含484ml水（经DEPC处理）,17.6ml0.75mol/L柠檬酸钠（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用（不超过3个月）。工作液－在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室温下保存不超过1个月。工作液各成分的终浓度为：4mol/L异硫氰酸胍25mol/L柠檬酸钠pH7.00.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)0.1mol/L巯基乙醇(2-ME)其它溶液：2mol/L乙酸钠(NaAc)缓冲液(pH4.0)水饱和酚（pH3.5）49∶1(v/v)氯仿/异戊醇100%异丙醇70%乙醇（用DEPC处理水配制）DEPC处理后高压灭菌水试验程序1．取0.5~1g左右新鲜植物组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。2．将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。3．顺序加入2mol/lNaAc0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml，每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。4．4℃条件下15000g离心30min.，将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。5．4℃条件下13000g离心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中（体积为第一次变性液的1/3），再加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。6．4℃条件下13000g离心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于适量体积（50μg/100μl）的DEPC处理水中，检测后分装，置于－70℃低温条件下保存。注意事项RNA提取过程中，为了保证所提取的RNA的纯度和完整性，其中有两个方面的问题需要特别控制，一是去除与RNA结合的蛋白质，二避免内外源Rnase对RNA的降解。在RNA的提取中，常采用的蛋白质变性剂有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸钠（SDS）等。为防止外源Rnase的污染，所有试验用品均需用DEPC处理并高压灭菌，所有试剂配制均需使用经DEPC处理过的水或灭菌处理。内源RNase的抑制采用异硫氰酸胍等强还原剂。为避免人体污染，所有试验操作均应带手套，避免人体接触所有用品。方法二、改良Krapp提取法试剂及其配制RNA抽提掖：母液：4mol异硫氰酸胍20mmolEDTA20mmolMESpH7.0工作液：取400ml母液加入1.7ml2-ME贮存在4℃条件下备用。RNA重悬液：2molLiCl10mmolNaAc调整终体积为250ml，pH5.2，灭菌后贮存在4℃条件下备用。试验程序1．取新鲜植物材料0.5~1g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入10mlRNA抽提掖充分混匀。2．4℃条件下8000rpm离心10min.，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4℃条件下8000rpm离心10min.。3．上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混匀后，在4℃条件下8000rpm离心10min.）。4．小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10vol3molNaAc和2vol冷无水乙醇，在-80℃条件下沉淀2小时。5．在4℃条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4℃条件下1小时。6．4℃条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70℃条件下保存。二、RNA质量检测提取的RNA需要对其质量和数量进行检测。实验室常用的方法有紫外吸收值检测和电泳检测两种。方法一、紫外吸收检测试剂：TE(10mmol/LTris,1mmol/LEDTA)。dH2O试验程序1．预热紫外分光光度计10～20min.。2．取两个1ml的狭缝石英杯，一个装入1mlTE溶液作为空白校正液，用来校正分光度计零点及调整透光度至100。3．取4μlRNA待测样品加入另一比色杯中，加dH2O至1ml，用无菌石蜡膜堵住杯口，倒转混匀。4．将两个比色杯置于分光光度计中，调入射光波长，用空白溶液分别调整T至100、OD至0，然后测定样品在260nm、280nm、230nm的OD值。RNA浓度和纯度分析浓度计算：对于单链RNA，OD260＝1.0时，RNA浓度为40μg/ml，按照上述稀释方式，即OD260＝0.1时，其RNA浓度为1μg/ml。纯度分析：纯净的RNA样品其OD260/OD280的比值应介于1.7~2.0，小于此比值说明有蛋白或苯酚污染，如果比值大于2.0则可能被异硫氰酸胍污染；OD260/OD230比值应大于2.0，如果小于此比值说明有小分子及盐类污染。方法二、变性琼脂糖凝胶电泳检测试剂及其配制MOPS缓冲液（10×）:200mmol/LMOPS(pH7.0)50mmol/LNaAc10mmol/LEDTA准确称取41.86gMOPS,6.8gNaAc,3.72gEDTA，先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc，再将MOPS溶解其中，再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA，混匀后用2mol/LdNaOH将调整pH至7.0，最后定溶至1000ml，过滤灭菌后避光保存。上样染料：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝其它试剂：甲醛（37%溶液，13.3mol/L）甲酰胺（去离子）将10ml甲酰胺和1g离子交换树脂混合，室温搅拌1小时后用Whatman滤纸过滤。等分成1ml于-70℃贮存。溴化乙锭（EB，10mg/ml）70%乙醇试验程序1．将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。2．配制琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热溶化均匀。3．待胶凉至60~70℃时，依次向其中加入9ml甲醛、5ml10×MOPS缓冲液和0.5μl溴化乙锭，混合均匀后立即灌胶（注意避免产生气泡）。4．样品制备：取DEPC处理过的500μl小离心管，依次加入10×MOPS缓冲液2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺（去离子）10μl、RNA样品4.5μl，混合均匀；将离心管置于60℃水浴中保温10min.，再置于冰上2min.；向每管中加入3μl上样染料，混匀。5．上样：将制备好的凝胶放入电泳槽中（上样孔一侧靠近阴极），加入电泳缓冲液（1×MOPS缓冲液），液面高出胶面1～2mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。用微量移液器将制备好的样品加入加样孔，每孔上样20～40μl。6．电泳：盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于7.5V/ml的电压下电泳2小时左右，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。RNA样品质量分析：完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28SrRNA、18SrRNA、5SrRNA。其中28SrRNA条带的亮度应约为18SrRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品比较完整，基本无降解。如果两条带的亮度反过来，则说明RNA样品已发生降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。植物总RNA中28SrRNA及18SrRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kbRNA的迁移率，以此可作为分子量的参考。三、为制备RNA探针模板的DNA片断亚克隆A．载体选择为了获得能够在体外转录RNA探针的DNA模板，其克隆载体必须带有可供选择的特异转录启动子，同时，为了获得理想的Northern杂交试验结果，载体选择带有两种不同类型而方向相反启动子的载体，以便在RNA探针制备时同时得到两条链的转录探针。常用的这类载体有：pGEM-3/pGEM-4(2.87kb,SP6/T7).pGEM-3Z(2.74kb,T7/SP6).PGEM-3Zf(-)(3.2kb,T7/SP6).BluescriptM13-(2.96kb,T7/T3).按照试验的经济有效原则，本试验选用BluescriptM13-。B.目的DNA序列与载体连接从所建立的CDNA文库中挑选出带有目的DNA片断的克隆，扩增后提取质粒，采用限制性内切酶处理或采用PCR特异扩增的方法分离出目的DNA片断；采用标准质粒提取方法提取载体质粒（见黄健试验）。然后按下列程序进行连接。试剂及其制备T4DNA连接酶连接缓冲液（可直接购买或配制），10X缓冲液配方为：0.5mol/LTris-HClpH7.80.1mol/LMgCl250mmol/L二硫苏糖醇（DTT）ATP5mmol/L(如果直接购买商品缓冲液，有的已加在缓冲液中，但有些需单独加入)。BSA0.25mg/LPEG(3500~8000均可，在缓冲液中加入2%~3%的PEG可提高平端连接效率)。无菌蒸馏水（SDW）试验程序1．建立以下反应体系（终体积20μl）：4μl质粒(50μg/μl)6μl目的DNA(100μg/μl)2μl10X连接缓冲液2μlDNA连接酶6μl无菌蒸馏水2．反应管置于15℃条件下保温反应24小时，65℃加热10min.终止反应。3．取5～10μl连接反应物用微型凝胶电泳检测连接效果，其余反应物于-20℃保存备用。注意事项1．保证连接反应中目的DNA与质粒载体的浓度比例在3∶1，因为高浓度的DNA有利于片断与载体的连接，低浓度的DNA则会增加载体自连。2．DNA连接酶对温度敏感，在15℃以上会迅速失活，因此，连接反应的温度控制必须严格。3．为了保证RNA探针的质量，模板DNA片断的完整性和纯度十分重要，在DNA制备时要严格控制。C．感受态细胞制备（CaCl2法）试剂及其配制LB培养基（200ml）：2g胰蛋白冻、1g酵母浸膏、2gNaCl，溶解后调整pH至7～8，定溶到200ml混匀，分装成50ml/瓶后灭菌4℃保存。CaCl20.1mol/L，4℃保存。E.coli菌株：JM105或TG1。试验程序1．将单菌落菌株接种于5mlLB培养基中，在37℃条件下振荡培养过夜。2．取0.5ml过夜培养的菌液接种于50mlLB培养基中，在37℃条件下振荡培养约3小时，用分光光度计检测OD600＝0.3～0.4时，取出培养瓶置于冰上完全冷却。3．将菌液转入离心管中，在4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。4．将沉淀悬浮于预冷的25ml0.1molCaCl2中，在冰上放置30min.后，于4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。5．沉淀重悬于2ml预冷0.1molCaCl2溶液中，菌液直接用于转化。或加入1.6ml80%甘油，按每管200μl分装于2ml的冻存管中，于液氮中速冻后-70℃保存备用。D.质粒DNA转化试剂及其配制LB培养基（同C）。氨苄青霉素：用无菌蒸馏水配制成50mg/ml的贮存液。含氨苄青霉素（AP）的LB平板：每升LB培养基中加入15g琼脂，溶化后高压灭菌，待稍凉后再加入氨苄青霉素至终浓度为50~100μg/ml。在超净工作台上用9cm灭菌培养皿铺板。IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：取2g溶于8ml双蒸水中，定容至10ml，过滤灭菌后-20℃保存。X–Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)：贮存液浓度为20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中，-20℃黑暗保存。试验程序1．取制备分装好的感受态细胞，置于冰上5min.，加入连接产物10μl，轻轻混匀后置于冰上30min.。2．然后置于42℃水浴中热击细胞50s.，再置于冰上2min.。3．向各管中加入200μl在37℃下预热的LB培养基，37℃下振荡培养1小时。4．与此同时，将LB平板置于37℃下片刻，每板加入44μlIPTG/X-Gal(4μlIPTG和40μlX-Gal)均匀涂布于平板表面放置约10min.使其吸附渗透。5．将步骤3中培养的菌液涂布在制好的平板上，吹干后（在超净工作台中放置片刻）置于37℃下培养过夜。含有插入片断的菌落为白色。E.转化质粒的快速检测试剂及其配制煮沸缓冲液：蔗糖8％TritonX-1001.5%EDTA(pH8.0)50mmol/LTris-HCl(pH8.0)10mmol/LLB培养基（同C）氨苄青霉素（AP）（同D）试验程序1．选取白色单菌落，接种到3ml含AP的LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜。2．将培养物等分成2份按菌落编号，每一菌落编号切勿出错。一份于4℃下保存备用，每一菌落编号切勿出错。另一份转入Eppendorf中，7000rmp离心2min.，弃去上清液，吸干残留液体。3．将沉淀菌体细胞悬浮于350μl煮沸缓冲液中，加入25μl溶菌酶后，涡旋混合。4．将管置于100℃沸水中煮40s.，取出立即在12000rmp条件下离心15min.。5．取10μl上清液，加入溴酚蓝染料后，在0.8%琼脂糖胶上电泳。6．在紫外灯下根据分子量检测插入片断的完整性。如果不能确定转化片断的大小，则要进一步杂交、测序分析。选取经检测含有完整目的DNA片断的菌落，转接于2mlTB培养基（每升16g胰化蛋白冻/10g酵母提取物/5g氯化钠）中，37℃下振荡培养过夜，取850μl菌液加入到一2ml的冻存管中，再加入150μl50%的甘油，混匀后置于液氮中快速冷冻，再置于-70℃条件下保存。四、模板DNA的制备A．质粒DNA的小量提取试剂及其配制含AP的LB液体培养基TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)溶液I：25mmol/LTris-Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA50mmol/L葡萄糖高压灭菌15min.后，4℃贮存。溶液II:0.2mol/LNaOH1%SDS（临用前现配制）溶液III（100ml）：5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5mldH2O28.5ml4℃贮存。酚∶氯仿（1∶1）95%和70%乙醇试验程序1．在纯净工作台上将5ml含AP的LB液体培养基加入到一10~15ml通气良好的试管中，然后将前述经鉴定含有目的DNA片断的转化细菌接种其中，37℃下振荡培养过夜。2．取1.5ml培养物置于一微量离心管中，在4℃下12000rpm离心2min.，弃去上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。3．将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中，剧烈振荡后加入200μl新配制的溶液II，盖紧离心管口，将其快速颠倒5次（切勿振荡），再加入150μl在冰上预冷的溶液III，盖紧离心管口，将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀，再将离心管置于冰上3~5min.。4．在4℃下12000rpm离心5min.，将上清液移至另一离心管中。5．加入等量酚∶氯仿（1∶1），振荡混匀，在4℃下12000rpm离心2min.，将上清液转入另一离心管中。6．加入二倍体积95%乙醇，振荡混匀，室温放置20min.，在4℃下12000rpm离心5min.，小心弃去上清液，倒置将液滴除尽。7．用70%乙醇洗涤一次，室温干燥10min.，用50μl含20μg/ml胰RNA酶（无DNA酶）的TE重新溶解质粒DNA，取1μl在含溴化乙锭的微型胶上进行电泳检测，其余置于-20℃保存备用。B．质粒DNA的线性化试剂及其配制NotI和SalI内切酶及其相应的缓冲液酚∶氯仿（1∶1）3mol/LNaAc(pH5.2)100%和70%乙醇DEPC-H2O试验程序1．在离心管中依次加入：质粒DNA10μl(1μg/μl)10×内切酶缓冲液10μldH2O80μlSalI或NotI2μl(10U/μl)2．37℃保温反应2小时以上。3．消化液用100μl的酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，每次在在4℃下12000rpm离心5min.4．将上清液转入一新的离心管中，加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠和2倍体积乙醇沉淀过夜。5．4℃下12000rpm离心20min.，弃去上清液，沉淀用70%乙醇洗涤一次，真空干燥。6．线性化质粒DNA按0.25μg/μl的浓度重悬于DEPC-H2O中，取10μl电泳检测线性化质量，其余于-20℃下保存备用。此帖被评分,最近评分记录财富:10(bywangsg)回帖是一种美德！欢迎大家来生命科学版和材料科学版！！！[楼主]|Posted:2005-11-1012:27hwzgj级别:初级版主精华:1发帖:1585威望:303点财富:23果果认证指数:63管理指数:96点在线时间:723(小时)注册时间:2005-05-07最后登录:2006-03-24五、RNA探针制备（根据theDIGsystemuser"sguide）A．地高辛标记的体外转录试剂及其配制（试剂盒提供）：10×NTP标记混合物：inTris-HCl(pH7.5)10mmolATP10mmolCTP10mmolGTP6.5mmolUTP3.5mmolDIG-UTP10×转录缓冲液：400mmolTris-HCl(pH8.0)60mmolMgCl2100mmolDTE(dithioerythritol)20mmol亚精胺100mmolNaCl1unit/mlRNase抑制剂。10unit/μlDNaseI(RNase-free)20unit/μlRnase抑制剂20unit/μlT7RNA聚合酶和T3RNA聚合酶4mol/LLiCl200mmol/LEDTADMPC-H2O