携带多个目的基因的重组腺病毒的制备

1、目的基因的获取：

（1）特定细胞表达的目的基因：提取RNA后进行反转录，PCR扩增；

（2）载体中含有的目的基因：酶切或PCR获取；

（3）融合蛋白基因：根据需求，进行PCR合成目的基因；

2、穿梭质粒的构建：

（1）携带目的基因的穿梭质粒的构建：通过酶切、连接的方式得到，一般采用的是pShuttle-cmv载体；

（2）携带多个目的基因的穿梭质粒的构建：如同时表达两个目的基因，可通过IRES将两个目的基因相连；

（3）携带干涉序列shRNA的穿梭质粒：首先将H1启动子构建到pShuttle质粒上，然后将目的基因克隆到H1启动子下游；

3、重组腺病毒质粒构建：

携带目的基因的穿梭质粒线性化后与Adeasy-1共转BJ5183感受态细胞（电转），筛选得到重组腺病毒质粒，并经PacI酶切鉴定：可见目的质粒出现两条条带，分别为3.0kb或4.5kb和>23Kb两条条带。将得到的重组腺病毒质粒转染DH5a感受态细胞，以便于保存。

4、重组腺病毒的制备：

将PacI酶切线性化的高纯度高浓度重组腺病毒质粒，以脂质体介导的方式转染293细胞，7～10天出现噬斑，待完全病变后，收集细胞和上清，于-70℃保存。

5、重组腺病毒的鉴定

在基因水平，提取腺病毒基因组DNA，采用目的基因的引物，PCR扩增病毒基因组DNA；并采用相应的引物，检测是否含有复制型腺病毒。

在蛋白水平，分泌蛋白，采用ELISA检测目的基因的表达；膜蛋白采用流式方法进行检测；其他蛋白采用Western-blot方法进行检测。

6、病毒扩增及纯化：

根据实验的需要扩增重组腺病毒（细胞实验20～40皿；动物实验60～80皿），并采用氯化铯密度梯度离心法进行纯化，纯化得到的病毒用10％甘油保存。

7、病毒滴度测定：

紫外分光光度法检测病毒的OD260和280值：根据OD260nm可推算病毒的颗粒滴度；OD260nm/OD280nm代表病毒的纯度。