磷酸钙转染法

磷酸钙转染法材料：质粒DNA指数生长的真核细胞2 M CaCl22×HBS （pH 7.05）配方:2×HBS （pH7.05）：900 ml 超纯水中加入NaCl 16.3 g, KCl 0.74 g, Na2HPO4 0.214g，Glucose 2.4 g 和HEPES 10 g，调pH 至7.05，定容至1 升，过滤（0.2 μm 滤膜）后储存于4℃备用。方法：1. 细胞分盘： 通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以1×105 至4×105细胞/cm2 的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的40－70％）。将细胞置于含5％CO2 的37℃温箱中孵育8-24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前2 h 换液（用4 ml 新鲜的完全培养基置换旧的培养基）。注：为得到较高的转染效率，尽量使用指数生长的细胞，转染时细胞的密度不超过80％。2. 制备磷酸钙－DNA 沉淀：以60 mm 组织培养皿用500 μl 反应总体积为例。在灭菌水中加入质粒DNA（总量4－10 μg 为佳），再加入31 μl 2 M CaCl2，使三者总体积达到250 μl，混匀。将等体积2×HBS 盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀。静置2 min 后，立即将这500 μl 的磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。注：可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色，应尽快将其混匀，避免形成过大的颗粒，影响转染效率。3．若转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5％ CO2 的37℃温箱孵育。8 h后吸去培养基与DNA 沉淀，加入5 ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，16-40 h 观察其转染效率。参考：分子克隆实验指南第三版（p1284～1285）