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苏州蚂蚁淘生物科技有限公司成立于2017年，是一家专业提供实验室整体采购方案的专业公司，为广大采购和实验室解决了大量问题，几年来已经成为所有合作伙伴最优秀的合作伙伴，我们一直秉承信誉第一的原则，坚持不卖假货，哪怕利润损失也要为客户提供最好的产品
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表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA（siRNA或shRNA）、Dicer酶，Argonaute蛋白家族的蛋白质（具体来说是Ago-2）、Drosha、RISC、TRBP和PACT。
| 术语 | 描述 |
|---|---|
| siRNA | 小干扰（siRNA），有在3’端有两个碱基的游离，可激活RNA干扰，通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现mRNA降解。 |
| shRNA | 短发夹RNA（shRNA），包含一个环结构，可加工成siRNA，也可通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现靶mRNA降解. |
| Drosha | 是一种核糖核酸酶III的酶，可加工细胞核中的前体-miRNA和shRNA。 |
| Dicer | 核糖核酸酶III酶，能够将双链RNA加工成在3‘端有两个碱基游离的20-25bp的siRNA。果蝇的Dicer-2能够剪切长的双链RNA，而Dicer-1对miRNA的加工有重要作用 |
| RISC | 最小RNA诱导沉默复合物（RISC）包含Argonaute蛋白和相关的siRNA。也可能包含PACT、TRBP和Dicer。需要注意的是RISC的组成尚未能得到确切的描述。 |
| TRBP | Dicer剪切双链RNA以及随后转运给RISC的过程中需要 |
| PACT | 蛋白R（PKR）-激活蛋白（PACT）。Dicer和TRBP参与双链RNA剪切相关. |
| Argonautefamilyofproteins | 和单链的RNA（siRNA）共同组装形成RISC。绑定21-35个核苷酸的RNA，包括miRNA和siRNA以及相关的靶mRNA，然后通过其内切核酸酶功能发挥剪切作用。剪切作用发生在反义链（引导链）RNA的第10th和第11th个核苷酸之间。 |
两个在RNAi途径的基因沉默中具有实质利害关系的是双链小干扰RNA（siRNA）和基于载体的短发夹RNA（shRNA）。虽然siRNA和shRNA（图1）都可用于蛋白沉默，但它们的作用机制有所不同（图2）。不管是长的双链RNA还是短的约21bp碱基对的双链都能够直接被转运到组织培养的细胞中（参见转运机制获取更多细节）。虽然有一些报道提到siRNA在转染细胞时是被转运到细胞核中的，但更普遍的看法是它们在细胞质中聚集。长的双链RNA与Dicer一起形成复合物，双链特异性的核糖核酸酶III能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-23nt的siRNA。随后这些siRNA片段与RISC结合，RISC由Argonaute-2（Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白（TRBP）组成。然后RNA的两条链分开，其中一条链从复合物上分离。5"端双链稳定性最低的那条链被选择出来，稳定的并入沉默复合物中。
shRNA在转染/转导细胞的细胞核中的合成，形成发夹结构，茎区成对的反义和正义链与未配对的成环核苷酸连接在一起（图1b和1c）。通过与miRNA的加工相同的RNAi机制，shRNA被加工成siRNA。使用细菌或病毒载体，shRNA被导入靶细胞的细胞核内，在某些情况下，载体可以稳定地整合到基因组中。根据驱动表达的启动子的不同，shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化转录。在被Exportin-5转运到细胞质之前，这些初始的前体结构需要首先用Drosha及其双链RNA结合伴侣DGCR8加工形成pre-shRNA。pre-shRNA随后被Dicer和TRBP/PACT酶切，去除发卡结构，产生在两个3‘末端带有两个游离碱基的20-25nt的双链siRNA。这一有活性的siRNA随后被整合到沉默复合物上去。
一旦被整合到RISC后，shRNA和siRNA识别靶mRNA和降解的过程基本上是相同的。作为RISC的一部分，siRNA通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶mRNA，从而利用Ago-2的核酸酶H样活性裂解靶RNA的双链中心附近的磷酸骨架。某些生物的这个系统有一个有趣的特点，siRNA与靶mRNA的退火使siRNA作为引物，而靶mRNA作为依赖于RNA的RNA聚合酶的模板。这就合成出一个新的双链RNA，然后由Dicer酶加工，形成正反馈循环，增加了siRNA的量。应当指出的siRNA通常需要完全同源才能诱导降解。该过程图2中有阐述。
人们对RISC发现靶mRNA的过程还没有很好的理解。然而，Ameres等的报告显示细胞mRNA的靶序列的亲近性影响了它的剪切。他们还指出，RISC不是作用于未折叠的RNA。他们提出了一个模型，在该模型中，RISC非特异性的方式通过随机扩散与单链RNA接触，5"末端碱基配对比3"末端更有效率。这似乎决定了RISC与靶mRNA的稳定结合。
shRNA比siRNA的优势包括能够使用病毒载体进行转染，克服了某些类型的细胞不能转染的难题，能选择使用诱导型启动子控制shRNA表达，能够与报告基因共表达。此外，它们能减少脱靶效应（在下面进一步讨论）。
许多实验室已发表了用于转染的长双链RNA的合成方案。但是，每种方法的效力是依赖于整个系统的。此外，长双链RNA会激活先天免疫反应，导致细胞死亡。影响shRNA活性的因素，包括环结构，发夹结构热力学性质，二级结构以及周围序列。siRNA和shRNA之间进行选择时，要考虑的一个重要因素是实验时间的长短。siRNA在细胞中瞬时表达的，而shRNA可以通过病毒介导的转导保持稳定。
siRNA/shRNA设计指导在主要RNAi产品制造商那里都能获得
| 公司/组织 | 程序名称 | 描述 | 链接 |
|---|---|---|---|
| ThermoScientific | siDESIGN | 方便使用的siRNA设计工具。允许选择siRNA识别的区域（5’或3’UTR或ORF区），G/C百分比，可通过BLAST搜索序列。 | 链接 |
| Naitoetal. | siDirect | 根据核苷酸序列识别目标，提供了序列内的位置，可供选择双链的熔解温度，脱靶序列的不匹配的最小数目。 | 链接 |
| Invitrogen | BLOCK-ITRNAiDesigner | 在核算序列内识别siRNA,shRNA和miRNA目标。也可将siRNA序列转化为shRNA序列。 | 链接 |
| InvivoGen | siRNAWizard | 可搜索一段编码序列作为siRNA序列，可根据您的siRNA序列设计加扰序列和发夹插入。 | 链接 |
| IDT | shRNA设计工具 | shRNA设计工具能允许您在四个环序列中选择或者输入一段定制序列，也可以指定5’端和3‘端的酶切位点。 | 链接 |
| GeneLink | shRNA设计工具 | shRNA设计工具能允许您在三个环序列中选择或者输入一段定制序列，也可以指定5’端和3‘端的酶切位点，设计GC含量和长度。 | 链接 |
shRNA应包含正义和反义序列（每个为19-21个核苷酸的长度）由环结构分隔，以及5"端AAAA的游离片段。设计环结构时，Ambion的科学家和其他人建议使用9nt的空白间隔（TTCAAGAGA），而Invivogen在某些载体中采用了长度为7nt的环（TCAAGAG），这可根据您的系统变化。3〜9个核苷酸长度的环序列被证明是有效的。此外，当创建shRNA盒时，正义链首先合成，然后是间隔序列，最后是反义链。shRNA结构中5"端游离应避免，因为它们可能会导致shRNA的沉默。除了手动设计siRNA或shRNA，也有一些设计程序可供使用。他们中有几个包含在表二中了。此外，多个公司提供预制的siRNA和shRNA序列（代表性例子见表三）。
多数shRNA通过载体转录而来。表达最常见的是由聚合酶IIIU6启动子驱动，它驱动高水平的组成型表达，或由较弱的H1启动子驱动。与siRNA系统相比，shRNA的一个主要优点是，shRNA可设计为诱导性的。有商品化的四环素-开和四环素-关诱导系统，以及结构含有改良的U6启动子由昆虫蜕皮类固醇性激素蜕皮激素诱导。一个Cre-Lox重组系统已被用来实现小鼠体内的可控制表达。也有合成的shRNA可用，它不像病毒载体递送分子，可以通过如上所述的siRNA分子一样，能够通过化学修饰影响其活性和稳定性。
| 公司/机构 | 程序名称 | 他们能提供什么 | Link |
|---|---|---|---|
| TheBroadInstitute（可通过Sigma-Aldrich和Thermo-FisherScientific进入） | RNAi联营（TRC） | 通过公共-私人的努力，目的是创造一个经验证的shRNA文库和可用于确定人和小鼠基因功能的关联工具 | 链接 链接到RNAi联营shRNA文库: 链接 |
| Sigma-Aldrich | 功能基因组&RNAi（与TRC协同） | 提供细菌甘油存储、质粒DNA和慢病毒形式的TRCshRNA | 链接 |
| Thermo-FisherScientific | SMARTchoice,GIPZ,TRIPZInducIBLe,和TRC慢病毒shRNA选项 | 提供细菌甘油存储和慢病毒形式的TRCshRNA。 | 链接 |
为确保RNA干扰（RNAi）处理后观察到的效应是基因沉默的结果，而不是仅仅因为引入的siRNA/shRNA，或由于RNA干扰途径激活造成的，很重要的一点在于设置相应的对照组（表三）。两种最常见的对照是加扰对照（ScrambledControl）和非识别对照（Non-targetingControl）。加扰对照正像它听起来的那样，包含获取siRNA或shRNA序列然后随机重新排列其核苷酸序列。非识别对照，在另一方面，也是一个siRNA/shRNA序列，它被设计成不能锚定靶生物的任何已知的基因。这些对照激活了RNAi机制，使得导入的双链RNA对基因表达有基本的影响。然而，应该指出的是，即使是非识别siRNA对照也会诱导细胞内的应激反应。虽然这两种类型的对照序列都将被纳入Dicer并激活RNAi途径，但加扰对照可能会针对一个预料不到的mRNA。因此，在设计加扰对照序列的时候要特别小心，以确保遵循上述原则，且不会锚定其他的mRNA序列。
对于shRNA，另一个重要的对照包括空载体对照，它不包含任何shRNA插入，却能保证转染/转导对基因表达的影响以及细胞的反应。最后，未经处理的细胞（无转染或转导）可作为参照比较其他细胞。这能允许您确定特定的siRNA转运方法的细胞毒性。
| 公司/机构 | 描述 |
|---|---|
| Sigma-Aldrich | shRNA非识别对照 |
| 空载体对照 | |
| ThermoScientific | shRNA阳性对照（识别eGFP） |
| 空载体对照 | |
| Invitrogen | 加扰siRNA对照 |
| 肌动蛋白,GAPDH,或GFP阳性对照 |
确切的siRNA或shRNA转运方案取决于您正在使用的细胞类型，因为不同类型的细胞核酸摄取的敏感性不同，包括您是否利用siRNA或shRNA介导的沉默，以及您正在做的实验的时间长度。转染、电穿孔、以及某些病毒转运方法是瞬时的，而慢病毒或逆转录病毒转导可将shRNA稳定整合到细胞基因组中实现持续表达。
转染和电穿孔是其中最常见的核酸转运方式。转染涉及核酸与载体分子复合物的形成，使它们能够穿过细胞膜。质粒编码的siRNA，有时也有shRNA，通常使用这种方法进入到细胞。商品化的转染试剂可以购买或在实验室自己制备。
苏州蚂蚁淘生物科技有限公司是一家经营医药标准品、化工环境标准品、高端试剂的专业公司，是全球领先科研方案的专业供应商。
自成立以来，公司坚持以“保障客户利益是我们的第一追求”为经营宗旨，发展成为全球多个高端标准品公司国内总代理和授权代理商，能提供超过100000种的有机和无机标准品或试剂，产品涉及药企，科研单位，检测机构，工厂实验室和高校等绝大部分科研单位；同时提供优质的咨询服务，实力雄厚。
公司以代理经营为主，代理20多个国外知名品牌的标准品、对照品，高端化学试剂，包括欧标EP,欧盟IRMM,日标JP,印度标IP,加拿大TRC,TLC,MC,英国BP,LGC,NIBSC,美国NIST,ChromaDex,美国Zyagen,挪威Chiron等。