多重PCR反应中关键因素和实验步骤（2）

多重 PCR反应的基本原理

DNA 引物（步骤 1 和 2 ） . 引物的选择遵从简单的规则：引物长度为 18-24bp 或更长， GC 含量为 35%-60% ，退火温度 55 ℃ -58 ℃或更高。长些的引物（如 DMD 基因的引物， 28-30bp ）使反应在更高的退火温度下进行并产生较少的非特 异性产物。使用软件 Primers 1.29( 从 ftp.bio.indiana.edu 下载的免费软件 ) 来计算熔点并检测可能的引物间的相互作用。使 用 BLAST 工具在 NCBI 序列数据库中对多对引物进行比对，以检测可能的重复序列。

单基因的 PCR( 步骤 3). 首先设计了一个分别单独扩增所有基因的 PCR 程序。反应混合物包括： 1xPCR 缓冲液， 0.4 μ M 引物， 5% DMSO 和 1U Taq DNA 聚合酶，共 25 μ L 反应体积。将在同一台 PCR 仪，在同型号的不同 PCR 仪上，在不同型号 PCR 仪上及在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果进行比较。在同一台 PCR 仪上或在同型号的不同 PCR 仪上扩增，实验的重复性很好，但在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果有明显差异，但是通过对循环条件的调节可以得到好的重复性。实验表明对于 100-300bp 的基因扩增产物，通过降低延伸温度可以增加某些产物的产量。对于单一 PCR 反应，退火时间与延伸时间并不明显影响结果，但改变退火温度可以改变 PCR 产物的特异性和产量。对于扩增 22Y 特异基因 (Figure 2a) ， PCR 程序 A 得到最佳结果 (Table 2) 。

多重 PCR ：等物质量的引物混合物（步骤 4 ） . 将引物以各种方式混合在同一反应中同时扩增多个基因要求对某些反应参数进行改变或优化 (Table 1 和 Figure 2b) 。初次进行多重反应时，各种引物按相等的摩尔数添加是很有必要的。结果将会揭示哪些引物的浓度或是哪些参数需要改变。下面将解释并讨论一些优化的例子，由于许多参数被提及不止一次，因此这些例子并未严格遵照 Figure 1 中所列的步骤。

• PCR/RT-PCR/qPCR

• 电泳设备
紫外设备
普通PCR仪
定量PCR仪
PCR/RT-PCR/qPCR试剂
PCR引物
PCR试剂
PCR对照
特异性PCR试剂盒
PCR克隆试剂盒
RNA
RNase检测/去除
RT-PCR试剂
RT-PCR标准品
定量PCR试剂
定量PCR标记
总RNA分离纯化盒
PCR产物纯化