抗体产生细胞的检测—溶血空斑实验一抗体产生细胞的检测

实验材料试剂、试剂盒仪器、耗材实验步骤注意事项
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健康小鼠

绵羊红细胞悬液Hanks液凡士林油

注射器平皿漏斗纱布研钵

1. 免疫动物取25%绵羊红细胞悬液1毫升，无菌操作注入小鼠腹腔中。 2. 脾细胞液的制备 （1）小鼠免疫4天后，颈椎脱位处死，取脾脏，去除脂肪组织，放平皿内，用冷Hanks液洗1~2次。 （2）取出脾脏研钵中研碎，加Hanks液2~3毫升，用吸管反复吹打数次，使细胞分散。将此细胞悬液经4~8层纱布过滤，1500转/分离心5分钟，弃上清。如细胞太多，可加蒸馏水4毫升迅速混匀，半分钟后立即加入等量Hanks液混匀1000转/分离心10分钟，弃上清。 （3）沉淀细胞用Hanks液洗1~2次，弃上清后，加Hanks液使总量达5毫升。用乳头吸管吹打使沉淀细胞悬起混匀，此即为50倍稀释的脾细胞。 （4）取此悬液0.1毫升放另一小试管中然后加0.9毫升Hanks液使成500倍稀释的脾细胞悬液。 3. 玻片小室的制作取洁净（无油）的载玻片，按下图粘三条透明胶带，在胶带上薄涂一层凡士林（勿涂到小室内），然后用镊子取两个盖片，分别放在其上，制成两个小室。用镊子尾端将盖片压平贴牢（保持小室一定体积）。用凡士林将盖片底端（其中的任一端）封住，顶端作为注入细胞混合液。图1 玻片小室示意图4. 细胞混合液的配制取小试管一只，用1毫升吸管吸取0.2毫升指示细胞悬液，用另一吸管吸取0.2毫升500倍稀释的脾细胞悬液，混匀即为被检的细胞混合悬液。 5. 混合细胞的灌注用100ul的微量加样器吸取被检细胞混合悬液，于小室开口一端轻轻将液体注满小室（勿使气泡产生，勿使液体外溢），记录实际注入的细胞悬液微升数（约70ul）每个样品注2个小室，取其平均值。 6. 用牙签粘取少许凡士林益封小室开口。 7. 将作好的标本水平置湿盒中，放37℃温箱中孵60分钟 8. 溶血空斑计数肉眼观察空斑并计数两个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑可在低倍镜下检查，真正的溶血空斑必须中心有一个淋巴细胞，周围为透明区。全脾脏中抗体产生细胞总数可依下述公式计算：

脾细胞悬液制备过程中应在冰水浴中进行。