零背景TOPOBlunt平末端克隆试剂盒（不含MCS多克隆酶切位点）

产品信息

产品描述

本试剂盒是利用拓扑异构酶（Topoisomerase）高效快速连接DNA片段的原理进一步研发而成，与传统的T4连接酶相比，具有以下优势：1）快速，仅需1-5分钟即可完成连接反应。2）高效，无自连现象，阳性克隆率接近100%，无需设置蓝白斑筛选；3）操作简单，从连接到涂板仅需15-20min。操作过程省去冰浴、热激和1h复苏。4）可连接长达10kb目的产物；5）HieffClone^TMTopo-bluntsimplevector不含多克隆酶切位点（MCS），使用者在引入后续酶切位点进行酶切操作时，不会受到MCS位点的影响，从而增加酶切效率以及克隆成功率。

产品用途

平端PCR产物的克隆。

克隆后PCR产物的快速测序【使用M13F/M13R引物】。

产品组分

运输和保存方法

冰袋运输。-20°C保存，避免反复冻融。有效期一年。

注意事项

1）pESI-Bluntsimplevector(30ng/ul)插入位点两端不含多克隆酶切位点，需要在PCR设计引物时引入合适酶切位点。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

♣ControlDNA片段的克隆实验

1）在无菌微量离心管中配制下列DNA溶液，以10μl为例。

2）混匀上述体系。于室温（20-30℃）反应5min。

【注】：连接反应不可于冰上进行。反应时间不要超过5min，一般1-2min即可完成连接反应，得到足够的重组子。

3）连接产物可直接转化或于-20℃保存。

4）全量10ml加入100ml感受态细胞，轻轻混匀，室温放置5min。

【注1】：也可取5ml连接液，加入50ml感受态细胞中（加入体积不超过感受态细胞体积的1/10)。

【注2】：通常使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5min便可获得足够多转化子，如果感受态细胞效率较低时，可以按照冰浴热激的标准程序进行。

5）加300-500mlLB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃180rpm振荡培养10min。

6）取200ml菌液涂板（含氨苄抗性的LB或SOC固体培养基），培养过夜（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000rpm离心1min，吸弃掉部分上清，保留100ml，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）。

♣一般DNA片段的克隆实验

所插入片段为平末端产物，利用高保真酶（如Pfu酶）扩增得到的产物如无非特异性条带、引物二聚体可直接进行连接反应。

否则建议胶回收后使用。

【注】：a、PCR产物不能***酸化。

b、如扩增模板为质粒，模板质粒会在后续实验中引起假阳性，因此推荐PCR产物进行胶回收后连接。

1）按照下表配制连接体系（以10μl为例^*）

【注】：*可根据具体实验情况按照上述比例调整反应体系。

**不同的插入片段所用量参考下表

2）混匀上述体系。于室温（20-30℃）反应5min。

【注】：连接反应不可于冰上进行。反应时间不要超过5min，一般1-2min即可完成连接反应，得到足够的重组子。

3）全量10ml加入100ml感受态细胞，轻轻混匀，室温放置5min。

【注1】：也可取5ml连接液，加入50ml感受态细胞中（加入体积不超过感受态细胞体积的1/10)。

【注2】：通常使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5min便可获得足够多转化子，如果感受态细胞效率较低时，可以按照冰浴热激的标准程序进行。

4）加300-500mlLB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃180rpm振荡培养10min。

【注】：通常商品化的感受态细胞不超过2kb插入片段情况下，10min复苏可以得到足够多转化子，如果感受态效率低或者插入片段长转化子少的情况下可以提高复苏时间到30-60min以得到更多的转化子。

5）取200ml菌液涂板（含氨苄抗性的LB或SOC固体培养基），培养过夜（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000rpm离心1min，吸弃掉部分上清，保留100-150ml，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）。

6）转化子的筛选鉴定

①菌液PCR鉴定；

②质粒大小鉴定：挑取单克隆，抽提质粒后可根据质粒大小进行鉴定。

③酶切鉴定：根据克隆实验设计，选择合适的限制性内切酶进行鉴定。

④测序分析：可选测序引物序列如下

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

【注】：本制品阳性率相当高，一般情况下，阳性克隆率接近100%，只要是长出来的菌落正常（不是污染的杂菌，转化子数量也不算太少），基本就是阳性克隆，因此插入片段不超过2-3kb的情况下可以不用鉴定直接挑1-2个菌去测序。

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