苏州蚂蚁淘生物科技有限公司是专业从事生物技术产品销售的高科技企业，是国内生物试剂、仪器、消耗品领域的知名企业之一。蚂蚁淘公司自成立以来，连续2年高速成长。公司的发展目标是建成专业从事生物技术产品销售、生产与开发的一流公司。 

TwistAmpnfo试剂盒

当时第一次看到这个技术的时候，简直可以用“震惊”、“惊艳”来形容。扩增速度真快啊，十几分钟就能出结果，比现在吭哧吭哧做PCR岂不是方便多了！可是几年过去了，似乎也没看到基于RPA技术的临床产品上市。说真的是有点失望的。就像对一部大导演拍的电影满怀期待，看完了发现其实不咋地是一样的心情。

 一、TwistDx公司的RPA技术重组酶聚合酶扩增（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA）具体原理不再介绍。2006年发明，到目前为止开发了一系列产品，都用在科研上。发表的论文也有一些，病原体检测、动植物检测都有。网上搜索了一番，发现整个2019年都没什么新闻，TwistDx官网的News板块还停留在2018年四月。公司被雅培收购以后，没什么动静。按理说这么优秀的技术，这么多年过去了，不应该没出临床产品。什么原因？成本高？（真正好的技术成本高点也无妨）专利？（不愿意授权给别的厂家共同开发产品？）技术本身准确性不如新闻说得那么好？雅培根本不重视这个方向？不得而知。 

二、等温扩增的技术难点笔者曾经接触过LAMP等温扩增一段时间。LAMP引物难设计，非特异扩增（假阳性）难消除；对实验条件要求不高，恰恰造成了容易污染实验环境；扩增时间跟样本浓度有关，低浓度样本扩增时间很长，跟荧光PCR相比时间上差不多。最终因为非特异扩增问题项目不了了之。

 三、国产等温扩增产品目前国内等温扩增科研产品不少，获得注册证的产品并不多。1.等温扩增微流控芯片北京某公司产品，LAMP方法，一次检测多种病原体。曾遇到某医生对这个仪器赞不绝口，使用方便，灵敏度较高。2.RNA恒温扩增上海某公司产品。据医生介绍（两年前），灵敏度不如荧光PCR法，结果不是很稳定。相信这两年产品性能已经有了改进。3.恒温扩增-层析法武汉某公司产品。做成了POCT产品，操作简便。如果能家用就更好了，感冒了在家里测一下，也省得去医院。但不知是如何规避污染问题的，卡盒如果没有密封措施，容易造成气溶胶污染。  

四、小结现在临床上荧光PCR使用广泛，既有大型的自动化工作站，也有小型的POCT产品。单纯靠等温扩增作为亮点并没有那么容易进入医院。不管是等温扩增还是荧光PCR，一个好产品最重要的还是结果准确、操作简便。有的技术号称扩增只需十几分钟，结果需要手工提取核酸花上一个小时，一样不实用。除了医疗用途，食品、畜牧等行业咱不懂，就不做评论。 

twistDx的重组酶聚合酶扩增（RPA）将彻底改变在资源有限的现场环境中扩增和检测核酸的能力。
RPA技术原理
RPA体系的重点是重组酶，这些酶与寡核苷酸引物形成复合体，并使引物与双链DNA中的同源序列配对。单链DNA结合（SSB）蛋白与被取代的DNA链结合，并使形成的D环保持稳定。然后从引物启动由聚合酶介导的DNA扩增，但前提是存在靶标序列。一旦启动，扩增反应将快速进行，因此开始时只需一点靶标DNA拷贝数，高特异性DNA扩增在数分钟内即可达到可检出水平。
RPA循环
 




RPA的技术特点
为什么选择RPA方法?
◇速度
RPA非常快速，在37～42°C这一通常最适宜的反应温度下，只需少量核酸分子即可在3～10分钟（通常）内扩增至可检出水平，但这将取决于靶标大小。在大部分情况下，只需要一个人即可在半小时内采集样本、制备样本、运行检测并取得结果，并且无需专业培训。
◇灵敏度
RPA可检测复合样本中的单拷贝DNA和10拷贝甚至更少RNA，而无需预先纯化核酸。
◇特异性
RPA具有高度特异性，该技术可从可能含有数百纳克来自多个不同物种的不相关复合基因组DNA（包括人DNA）的样本中识别并扩增单个DNA分子，抗干扰能力强。
◇恒温运行
RPA在恒定的低温（37～42°C最适宜）下运行。对于某些应用，如果需要，即便体温也可支持RPA扩增。该反应在偏离温度及低温设置下也表现稳健，即使在常规室温25°C下也将奏效，虽然反应速度会下降;在此温度下，只要此生物化学过程被正确配置，仍可在一小时内获得结果。
◇样本容差
RPA对样本类型的要求宽松，有时可直接检测未经核酸纯化的原始样本，例如血液、鼻拭子或培养基。通常，只需采用基本的病原体裂解方法处理样本以释放核酸即可，例如热处理或弱碱处理。每种检测所需的最合适的样本制备方法取决于病原体滴定度、是否存在抑制剂以及裂解要求等因素，并将需要设计到检测程序中。RPA对某些复合样本类型的宽容性使该技术非常适合广泛的现场实地应用。
◇广泛的适用性
RPA能够方便地应用于任何DNA或RNA靶标，无序列偏好性，这一点对于NGS尤其重要。如果将逆转录酶添加到反应混合液中开发出了超高灵敏度的RNA一步检测法。
◇多重检测
通过将多种引物同时添加到同一反应管中，单次RPA测试即可扩增和检测多种不同的靶标。
◇低设备成本
RPA仅需要基本的检测设备，也就是说，最终用户可以使用RPA技术开发出适合各种应用和环境的人性化诊断方法和试剂盒。
◇灵活的试剂形态
核心反应组分能够以稳定的干燥形态供货，该形态易于运输，且无需冷藏即可储存最多12个月（稳定性可能因用途不同而有变化，因此仍建议在冷藏条件下长期储存），也能够以PCR试剂更常见的液体形态供货，该形态允许用户针对特定的应用改变反应体积和组分比例。
◇多种检测形式
RPA可应用于各种检测系统和仪器，包括实时荧光探针和夹心法等形式。


RPA与其他核酸扩增方法PCR及LAMP的比较



产品系列
 

TwistAmp^® 试剂盒（随附冻干试剂）的试剂形态具有高度便利性，非常适合在现场、床边等环境中使用，而且特别适用于无法维持冷链的情况下。TwistAmp^® 研究试剂盒包含使用最终用户设计的特定引物进行核酸扩增时所需的所有试剂。
包含冻干试剂的TwistAmp^® 试剂盒具有以下优势：
*RPA扩增温度要求低，允许使用低成本、便于携带的检验设备。
*干RPA试剂足够稳定，可以在室温下运输。
*允许多种「适宜现场的」检测输出技术，例如侧向层析技术和荧光技术。
*RPA对一些复杂样本类型表现出高度稳健性（即样本耐受性），更适合于许多不同的现场实地应用。
除了在现场实地使用中的优势，通过TwistAmp^® 试剂盒还便于为许多应用和用途开发出快速、特异且灵敏的DNA和RNA检测方法。




 

TwistAmp^® Basic试剂盒可实现DNA扩增。包含DNA扩增所需的所有酶和试剂，用户只需提供引物和模板。使用TwistAmp^® Basic时，即使PCR引物也有效。TwistAmp^® Basic已被用于固相、加尾引物、配基、电化学和微阵列等应用。
非常适用于：终点凝胶电泳DNA检测、下游应用（例如亚克隆）
 


TwistAmp^® exo试剂盒可实现实时荧光DNA扩增。若想要以均相形式将TwistDxRPA扩增技术与TwistDx专利荧光TwistAmp^® exo探针结合使用，则推荐使用本产品。用户只需提供引物、探针和模板。更多信息请参阅手册。
非常适用于：实时荧光DNA检测
 

TwistAmp^® nfo试剂盒可实现横向流动检测用DNA扩增。若想要通过终点夹心法（例如横向流动[LF]试纸条）检测有效DNA扩增反应的产物，则适合使用本产品。用户只需提供引物、探针和模板。
非常适用于：开发低成本的现场侧向层析检测方法。
 


TwistAmp^® Liquid是为了提供散装液体形态的核心RPA组分，最终用户能够以不同的比例混合这些组分，以便用户为各自的应用配制预混液*。
TwistAmp^® Liquid具有以下优势：
最终用户可自由调整预混液制备量，而不再被局限于冻干试剂的固定体积
最终用户可自由调整反应体系中的组分比例，这使RPA试验开发工作具有更大的灵活性
TwistAmp^® LiquidBasic是一款最适合用于凝胶分析或者作固相、加尾引物、适配体、电化学和微阵列应用的DNA扩增试剂盒。TwistAmp^® Liquidexo是一款用于以实时荧光检测扩增反应的DNA扩增试剂盒。
 



 

以灵活的液体形态实现DNA扩增。包含DNA扩增所需的所有酶和试剂，用户只需提供引物、dNTP和模板。更多信息请参阅手册。
非常适用于：终点凝胶电泳DNA检测、下游应用（例如亚克隆）、便于使用不同的RPA反应体积或改变组分比例
 

以灵活的液体形态进行实时荧光DNA扩增。若想要将RPA与TwistDx专利荧光TwistAmp^® exo探针结合使用，则推荐使用本产品。除了基本的组分，还包含强大的核酸酶（核酸外切酶I），该酶将在扩增反应期间处理TwistAmp^® exo探针并产生实时读出。用户只需提供引物、探针、dNTP和模板。
非常适用于：实时荧光DNA检测，便于使用不同的RPA反应体积或改变组分比例

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