单细胞转录组测序分析人脑胶质瘤中肿瘤相关巨噬细胞存在差异的分子机制

肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associatedmacrophages,TAM）是浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞，是肿瘤微环境中最多的免疫细胞。胶质瘤中TAM大量存在。TAM按来源包含两个亚群：第一种为来源于大脑的驻留髓样细胞（也称为小神经胶质细胞），其祖细胞在早期发育中迁移到中枢神经系统；第二种为从骨髓衍生的单核细胞分化出的巨噬细胞（BMDM）。由于缺乏特定的标志物来分开这两种细胞亚群，使两个亚群间差异的研究停滞不前。目前，BMDM在多大程度上浸润未经治疗的人类胶质瘤，以及在恶性条件下，BMDM是否会转变为脑内小神经胶质细胞的表型，这些都尚不清楚。

基于FluidigmC1平台和10XGenomics平台，本文研究人员利用单细胞转录组测序（scRNA-seq）来研究人类脑胶质瘤中的TAM，通过与人体组织来源的非恶性小胶质细胞，小鼠模型中的巨噬细胞及不同亚群巨噬细胞的基因表达情况进行比较，来回答上述问题。相关研究结果发表于12月20日《GenomeBIOLOGy》上。

（一）肿瘤组织获取及处理

从未经治疗的患者身上获得新鲜手术切除的胶质瘤肿瘤组织。组织用木瓜蛋白酶（papain）进行解离，制备单细胞悬液。同时，部分样本利用CD11b微珠(MiltenyiBiotec)分选出CD11b+细胞。

（二）单细胞转录组测序

1.基于FluidigmC1的scRNA-seq：3例原发性胶质母细胞瘤（GBMs）和一例原发性三级（grade3）少突细胞瘤
2.基于10Xgenomics的scRNA-seq：2例原发性GBMs和一例原发性二级（grade2）星型胶质细胞瘤。

图1单细胞测序实验方案

（三）研究结果解读

为了增加TAM的数量，研究人员使用标准的巨噬细胞标志物CD11b，从四个病例（两个GBM，一个G3oligo，一个G2astro）中纯化TAM。并通过流式细胞术验证了分离方案，表达CD11b的细胞的纯度超过了96％。对于这些病例，分别对全肿瘤（wholetumor）悬浮液和CD11b纯化的悬浮液进行scRNA-seq。接下来试图从全肿瘤scRNA-seq数据中分析出TAMs，同时过滤掉CD11b纯化的scRNA-seq数据中测到的任何非TAM。

基于FluidigmC1和10XGenomics的单细胞转录组测序

首先，从基于FluidigmC1的scRNA-seq获得了672个细胞。去除了206个具有低测序深度和/或低转录本多样性的细胞。然后基于两种方法分离scRNA-seq数据：（1）通过基因表达聚类;（2）分析匹配的外显子测序（exome-seq）数据中鉴定出的体细胞突变克隆。结果发现从全肿瘤scRNA-seq鉴定的TAM与从CD11b+悬浮液测序的TAMs聚集在一起，并且与来自全肿瘤scRNA-seq中推定的肿瘤细胞明显分离。tSNE和聚类分析都显示出肿瘤细胞群与TAM群体之间的存在明显的分离（图2，3）。推定的TAM没有表达的体细胞突变的基因，但显著表达II类人类白细胞抗原和其他巨噬细胞特异性基因。

图2来自全肿瘤和CD11b纯化的scRNA-seq数据的t-SNE图

图3 按照标记基因（行）的表达进行细胞分组（列）的分级聚类图

对于10Xsinglecell数据，基于经典的巨噬细胞标记物，首先从CD11b纯化的scRNA-seq过滤非TAM。与流式细胞术的CD11b纯度评估一致，91％的细胞（n=907）被鉴定为TAM。然后，从CD11b纯化的scRNA-seq与来自全肿瘤10X的scRNA-seq的细胞一起进行TAM的表达聚类，确定了额外的3132个TAM。

本分析中对FluidigmC1和10X数据采取了不同的过滤方法。最终用于后续分析的scRNA-seq数据集包括来自19位患者的5455个TAM（1274个公开的细胞数据和4181个新的单细胞数据）。

用来区分小鼠不同来源TAM的基因集在人脑胶质瘤中是保守的

小鼠神经胶质瘤模型中区分BMDM和小胶质细胞TAM的差异表达基因共计有836个。作者认为这些基因可能包含区分人脑胶质瘤中TAM群体的一些重要核心基因。经过分析最终确定了66个基因作为核心标志物，它们在人和小鼠的恶性和非恶性组织中的小胶质细胞和血源性巨噬细胞中差异表达显著。

不同发育来源的TAM富集在不同的肿瘤解剖结构中

研究人员对从苏木精和曙红（H＆E）染色鉴定的特定神经胶质瘤解剖结构的显微切割样本进行了RNA-seq。数据分析显示人类小胶质细胞TAMs的基因标记物富集于侵入的神经胶质瘤边缘和浸润相邻的白质区域。血源性TAM特异性基因定位于增生性血管，微血管和坏死周围区域。

图解剖学定义的不同肿瘤区域的基因表达

对神经胶质瘤组织切片中的TGFBI和BIN1的进行原位杂交。这两个基因是我们的66个区分血源性巨噬细胞和小胶质细胞的标记基因。正如预测的那样，TFGBI在推断的血管附近富集。BIN1富集于浸润的白质区域。

图 BIN1和TGFBI在解剖学注释的区域（用颜色表示）的原位杂交图

不同来源的TAM表达谱存在差异

来自小鼠和人类非恶性皮层的scRNA-seq数据中，不同的基因表达谱将脑源性的血管周围巨噬细胞与小胶质细胞起源的巨噬细胞分开。这些血管周围的巨噬细胞来自于渗透血脑屏障的外周单核细胞。人类血液和小胶质细胞的TAMs之间的差异表达分析证实了血液来源的TAM的吞噬表型。与小胶质细胞TAM相比，血源性TAM吞噬溶酶体的许多结构成分和各种吞噬促进受体基因高表达。

图脑源性血管周围巨噬细胞与小胶质细胞起源的巨噬细胞表达存在差异

最后，研究还证实血液来源的TAM的基因表达因神经胶质瘤亚型而异，并且与LGG总生存期缩短显著相关。同时，单细胞数据显示血液来源的TAM，M2型巨噬细胞的标志物（如IL10，TGFB2以及一些与氧化代谢有关的基因）表达量增加，并且与M1型巨噬细胞的标志物共表达（如TNF-α）。选取的几个样本蛋白水平证实，不论是血液来源的还是小神经胶质细胞来源的TAMs中，M1型及M2型巨噬细胞标志物经常性的共表达。

（四）总结
越来越多的证据表明，全身性免疫激活是有效抗肿瘤反应所必需的。外周血中的BMDM对所有TAM贡献的程度以及如何形成巨噬细胞激活对于免疫疗法的发展是至关重要的。本文章中使用scRNA-seq，结合公共数据数据进行meta-analysis，结果显示血液和小胶质细胞来源的TAM在肿瘤内表现出不同的表型和不同的定位。血源性TAM上调M2型相关免疫抑制细胞因子和M2表型特征的氧化代谢标志物。这些结果支持特异性的针对血源性TAM进行免疫抑制性的治疗策略。反对不区分TAM来源的靶向治疗策略。这项工作是scRNA-seq在GBM衍生的骨髓细胞中的首次应用，本研究提供的数据和结果提供了对未经治疗的胶质瘤中先天免疫的数据，将有助于未来研究治疗对免疫反应的影响。

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参考文章：Single-cellprofilingofhumangliomasrevealsmacrophageontogenyasabasisforregionaldifferencesinmacrophageactivationinthetumormicroenvironment.DOI10.1186/s13059-017-1362-4

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