通过实时荧光定量PCR技术实现对miRNA靶向物mRNAs的相对定量分析

1 导言

小RNA（miRNAs）是一种内源性非编码蛋白的小分子RNA，它们是许多基础的细胞过程中基因表达的主要调节因子，这些过程包括细胞增殖、细胞分化以及细胞凋亡等。miRNA在肿瘤生长过程中也发挥着重要作用。一般来说，miRNA通过控制翻译过程来实现对目标蛋白表达的调控。然而，在靶向mRNA降解水平上的基因表达的调控已有报道。因此，有证据显示miRNA能够通过RNA降解来实现对细胞内mRNA浓度的直接调控，而且也会通过靶向作用于蛋白质级联来调控mRNA水平，这些蛋白质级联能够调控下游转录或在转录后对mRNA水平进行调控。

在当前的研究中，我们重点关注miRNA hsa（人）miR-21，研究发现在乳腺癌和其他肿瘤中miR-21水平上调。更进一步的研究发现，miR-21在细胞凋亡和细胞生长过程中也发挥着功能性作用。为了进一步对miR-21进行研究，我们研究了miR-21的水平对三个假定的miR-21靶向基因（PDCD4，PTEN和TLR2）mRNA表达的影响（见图1）。

图1： 利用假定的miR-21靶向基因（PDCD4，PTEN和TLR2）的表达水平分析从而对has miR21进行分析的工作流程。

2 材料和方法

细胞培养

DMEM培养基中补充1%的L-谷氨酰胺，1%的盘尼西林/链霉素，10%的FBS，在+37℃ 5%CO2条件下培养HeLa细胞。用miRNA 21 miRIDIAN类似物，miRNA 类似物miRIDIAN对照，miRNA 21 mi RIDIAN抑制剂和miRNA miRIDIAN抑制剂对照siRNA（dhar-macon都为50nM），以及X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司），按照生产商的方案进行转染。

RNA提取与逆转录

在转染之后两天，使用High Pure RNA Isolation Kit（罗氏公司），按照生产商的建议从HeLa细胞中提取总RNA（每个类似物miRNA三个生物学复制）。同时，使用High Pure miRNA Isolation Kit（罗氏公司），按照使用说明书上的指导，提取包含小分子量RNA在内的总RNA（两个生物学重复）（见图2）。按照生产商的指导，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（罗氏公司）和oligo（dT）₁₈与随机六聚体引物的混合物，按照每次反应500到1000ng总RNA的量进行第一链cDNA的合成。用miRCURY LNA First-strand cDNA Kit（Exiqon）进行miRNA 第一链cDNA的合成，每次反应使用4ng含有小RNA在内的总RNA。

图2：用指定试剂（miRIDIAN miRNA类似物或miRIDIAN miRNA抑制剂）转染HeLa细胞后，用Agilent生物分析仪对来自不同细胞集群的小分子量RNA进行凝胶电泳。