不可不知的转染技术

美国Signagen生物公司是一家专注于开发和生产基因转导工具的企业,服务于生物医学研究领域。借助我们独有的技术平台（美国专利商标局号码为072308和61135606），SignaGen已经成功开发出三大类DNA/siRNA转染试剂，经验证我们的产品比市场上主导产品效率更高，细胞毒性更低。更重要的是我们提供一个低廉的价位。

1.生物可降解聚合物(BDP)合成：

BDP技术是我们的专利技术，这种技术让我们能合成生物可降解聚合物。与其他阳离子聚合物如聚(赖氨酸)和聚(乙烯亚胺)和阳离子脂质体不同，这种新型聚合物具有一个独特的主链，它可以携带DNA/siRNA进入哺乳动物细胞内并被降解(如图1)，并且细胞毒性很小。此外，这个新型聚合物拥有卓越的核酸聚合物亲和力、高缓冲能力、满足了一个好的基因载体的基本设计准则。体外DNA转染实验表明这种新型聚合物传递DNA到HEK293T细胞的速度是聚(乙烯亚胺)的2~10倍。

图1：可生物降解的聚合物DNA转染示意图

2.病毒蛋白质模拟（VIPs）技术：

基因治疗是先进的技术，它通过基因传递和表达来治疗人类遗传病和后天获得性疾病。而安全，有效，可控的基因载体是基因治疗临床成功的一个先决条件。虽然病毒载体传递基因的效率很高，其潜在的免疫原性和安全性增加了其在临床应用的风险。我们开发了VIPs技术来模拟病毒核酸靶向肽序列，用它来替代病毒载体。依托VIPs技术平台，一系列模拟病毒核酸靶向肽序列(例如，慢病毒)被创建，合成和筛选出来。据证实，与脂质体结合的DNA转染试剂，这些模拟肽序列能够穿透细胞核膜孔，从而使DNA/siRNA直接进入细胞核(图2)。初步结果表明，一些模拟肽序列在各种哺乳动物细胞中能显著提高以脂质体为基础的基因传递效率。有趣的是这种协同效应在难转染的非分裂细胞中发现，同时为难转染的细胞提供一个潜在的非病毒核酸载体。

图2.具备VIPs模拟肽的脂质体转染试剂的协同作用

3.转染介导的细胞毒性去除技术：

在DNA/siRNA转染期间，会遇到以下转染技术困境：高效率的转染试剂通常还有很强的细胞毒性。有时毒性太强，在转染之后大量细胞死亡。因此，研究人员通过降低转染效率来换取相对健康的转染细胞。我们现在提供了一个解决方案，以实现最大的转染效率。通过除去转染介导的细胞毒性来保持相对良好的细胞活力。经过多年的研究，我们发现它是转染复合物粘在细胞边缘导致细胞毒性(图4，上图)。由于转染复合物的性质，所以转染后更换培养基是不可能洗去复合物的。我们开发了一个独有的产品。几种化学物质被混合制成混合物(正在申请专利，美国专利商标局专利号为#62375686)在室温下孵育5分钟被证实能有效的去除所有结合到细胞边缘的转染复合物(图4，下图)，从而消除了转染介导的细胞毒作用。
图3.如何去除转染介导的细胞毒性技术运作图

4.pH依赖的构象变化(PDCC)是最有效的siRNA转染技术：

脂质体或聚合物试剂通常能有效传递DNA，他们未能有效地驱使siRNA到哺乳动物细胞内。转染siRNA的脂质体或者聚合物转染效果不佳，这可能与siRNA阴离子片段长度有关。siRNA阴离子片段太短以至于用阳离子脂质体和阳离子聚合物难以维持静电内聚力。因此，siRNA的脂质体复合物或复合物的分解很容易由于接触聚阴离子细胞表面。我们用特定的疏水基修饰了脂质体和聚合物，这些疏水基在生理PH条件下导致Ph依赖的构象变化(PDCC)，极大的稳定了siRNA脂质体和聚合物。由PDCC技术引起的一个重要特性是添加一个病毒大小的特殊疏水基团就可以稳定siRNA脂质体或者聚合物从而达到比较好的siRNA的转染效果。
图4：PDCC技术的工作原理图.

5.最大量生产腺病毒的Ad.MAX技术：

Ad.MAX技术主要是通过基因修饰病毒包装细胞、HEK293细胞、腺病毒穿梭载体或者腺病毒基因组来实现腺病毒生产最大化。这个专有技术的核心是通过遗传工程的方法使得HEK293细胞中腺病毒复制区保持完整而病毒蛋白的表达受到极大抑制。通过腺病毒基因组中的反式成分识别HEK293细胞中的抑制区域，Ad.MAX系统允许最大腺病毒产生和最低蛋白的表达。这个体系对包装腺病毒载体含有感兴趣的毒性基因非常有用；这些毒性基因在伴随腺病毒复制和增殖的时候会杀死HEK293细胞，导致腺病毒产量大幅降低。最终，Ad.MAX技术可以让研究人员利用腺病毒构建所有(＜7.5KB)的基因。
图5：Ad.MAX技术的工作原理

6.多途径产生超感染性、超高滴度腺相关病毒颗粒：

与腺病毒不同，用常规的生产程序很难获得高浓度的rAAV。通过采用以下多重方式，我们能成功的得到超感染性(比传统的腺相关病毒的感染能力高出30多倍)，且腺相关病毒颗粒达到超高滴度(可达1E+15VG)。

-AAVHT包装细胞：我们已经筛选了不同的HEK293细胞类型并且开发出一高产量细胞株——AAVHT包装细胞，经过我们验证这个包装细胞生产rAAV颗粒是常规的HEK293的10倍多。

-修饰rAAV顺式载体：顾客可以选择转基因中截去WPRE区域下游的部分作为rAAV顺式载体。有WPRE区域的rAAV顺式载体产生rAAV微粒是没有WPRE的8倍多。

-修饰rAAV外壳：rAAV外壳包含一些特殊位点的突变可以加强（体内、外30多倍）rAAV转染效率。客户可以运用突变的外壳来包装rAAV，以此来生产更多的感染性rAAV载体。

-包装双链腺病毒（dsAAV）：双联AAV也可称为自我互补AAV。它在体内外有高达50倍的转染效率。定制服务就是生产和包装以scAAV为载体的感兴趣基因片段。详情见图6。

-两次氯化铯超速离心优化程序:这个优化程序的主要特点在于样本超速离心前，用特殊配制的去污剂对转染的细胞进行3次循环冷冻、解冻和预沉淀的处理。这个程序产生超纯(临床实验级)、超感染的高产量的腺相关病毒载体。详情见图7。与传统生产程序的差别用红色标示在框架中。
图6.生产超感染性、超高滴度腺相关病毒颗粒示意图

图7.优化程序和传统程序的比较和基本步骤。优化程序中的不同用红色标示在框架中。

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