CIK/DCCIK及其在细胞治疗上的应用

CIK细胞优势：杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。【培养原理】CIK培养用细胞因子和抗体：1. CD3激发型单抗：T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成 TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或 CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或 MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-γ等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致 T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起 T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的 CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的 T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的 T细胞均能被激活。2. IL-2 (白细胞介素-2)IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。3. IFN-γ(干扰素-γ)IFN-γ具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-γ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-γ加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-γ，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。4. IL-1α(白细胞介素-1α)IL-1α也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1α与IFN-γ和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK的细胞毒作用。【细胞制备】1．外周血单个核细胞的采集1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；1.3 无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。2．CIK细胞的培养及鉴定2.1 将PBMC按1-2x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml的重组人IFN-γ，37oC，5%CO2培养箱中培养；2.2 24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300 U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1α。2.3每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；2.4在培养的第14d，收获CIK细胞。2.5 CIK细胞质控：2.5.1 台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；2.5.2 流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。2.5.3 细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10:1(数目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200μl，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。2.5.4收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素【步骤简图】

【推荐试剂】