affymetrix芯片实验步骤－中文版

目录

第一章总RNA的纯化（RNeasy®Kit）.............................3

第二章由RNA合成双链DNA..............................................4

一、反转录合成第一链cDNA............................................4

二、反转录合成第二链cDNA............................................5

第三章生物素标记cRNA合成.............................................6

三、体外转录合成标记cRNA............................................6

四、aRNA纯化..................................................................6

第四章杂交、洗涤、染色、扫描芯片..................................8

五、片断化...........................................................................8

六、杂交...............................................................................8

七、洗涤、染色和扫描.......................................................9

第一章总RNA的纯化（RNeasy®Kit）

通常在使用TRIzol法抽提组织总RNA时，因为方法的限制，造成总RNA的纯度降低，影响探针的标记和芯片杂交。所以需使用QIAGENRNeasyKit进一步的纯化。详细操作原理和方法见RneasyMiniProtocolforRNACleanup。

1.根据需纯化的样品数配制DNaseI混合液，每个样品需要80μL的DNaseI混合液，按10μLDNaseI的储存液加入70μLBufferRDD配制。

2.取经质检合格的总RNA≤100μg溶解于100μLRNase-free的水中，再加入350μLBufferRLT并充分混匀

3.加入250μL无水乙醇，Tip头充分混匀。

4.将共计700μL含总RNA的溶液转入套在2mL离心管内的RNeasymini柱子内，8,000g离心15~30s，弃去滤过液。

5.加350μLBufferRW1到离心柱内。盖上管盖，8,000g离心15s，弃去滤过液。

6.直接加入DNaseI混合液（80μL）到离心柱膜上，室温放置15min。

7.加350μLBufferRW1到离心柱内。盖上管盖，8,000g离心15s，弃去滤过液。

8.吸取500μLBufferPRE到RNeasymini柱子内，8,000g离心洗涤15s，弃去滤过液，再用500μLBufferPRE在8,000g离心洗涤2min，弃去滤过液和2mL套管，将RNeasymini柱子转入一新的1.5mLEppendorf管中。

9.吸取40μLRNasefree的水，≥8000g离心洗脱1min。

10.重复步骤9一次。

11.测定OD值（通常OD数值在1.8~2.1之间）

第二章由RNA合成双链DNA

一、反转录合成第一链cDNA

1、准备Poly-AControl

按下表稀释Poly-AControl：

表1.1

2、准备总RNA/Poly-ARNAControl混合液

在冰上按照下表准备总RNA/Poly-ARNAControl混合液。

表1.2

3、准备第一链反应混合液

A、在冰上溶解一链反应试剂

B、在冰上按照下表准备第一链反应混合液。

表1.3

C、转移5μL准备好的第一链反应混合液到反应管。

4、加RNA/Poly-ARNAControl混合液

A、转移5μL准备好的RNA/Poly-ARNAControl混合液到已经分装好第一链反应混合液的反应管中，至总体积10μL。

B、轻轻振荡混匀，低速离心收集反应液到管底。

5、运行反应

A、在PCR仪上运行42oC2h。

B、反应后低速离心收集反应液到管底，放置冰上并立即进行第二链cDNA合成反应。

二、反转录合成第二链cDNA

1、准备第二链反应混合液

A、在冰上按照下表准备第二链反应混合液：

表2.1

B、轻轻振荡混匀，低速离心收集反应液到管底。

C、转移20μL第二链反应混合液至（10μL）cDNA样品管中，混匀，低速

离心收集反应液到管底。

2、运行反应

A、在PCR仪上运行16oC1h，65oC10min。

B、反应后低速离心收集反应液到管底，放置冰上并立即进行IVT。

第三章生物素标记cRNA合成

三、体外转录合成标记cRNA

1、准备IVT混合液

A、在室温按照下表准备IVT混合液。

表3.1

B、轻轻振荡混匀，低速离心收集反应液到管底。

C、转移30μLIVT混合液至（30μL）双链cDNA样品管中，混匀，低速离

心收集反应液到管底。

2、运行反应

A、在PCR仪上运行40oC，时间长度依赖于起始RNA投入量，见下表。

表3.2

3、立即纯化或-20oC保存。

四、aRNA纯化

提前在50~60oC预热aRNAElutionSolution10min以上。

1、准备aRNABinding混合液。

在室温按照下表准备aRNABinding混合液。

表4.1

2、加aRNABinding混合液

A、加60μLaRNABinding混合液到每个样品。

B、转移样品到U型板。

C、用枪上下混匀几次。

3、aRNABinding

A、加120μL100%乙醇到每个样品。

B、用枪上下混匀几次。

C、轻轻振荡混匀，≥2min。

4、RNABinding磁珠收集

A、转移U型板到磁力架上放置约5min。

B、小心吸取上清，丢弃，取下U型板。

5、洗涤磁珠

A、加100μLaRNAWashSolution到每个样品，振荡1min。

B、转移U型板到磁力架上放置约5min。

C、小心吸取上清，丢弃，取下U型板。

D、重复A-C一次。

E、剧烈振荡U型板1min。

6、aRNA洗脱

A、加50μL预热的（50~60oC）aRNAElutionSolution到每个样品中，从磁珠上洗脱下纯化后的aRNA。

B、剧烈振荡U型板3min。检查磁珠是否全部混匀，如果没有，继续振荡至磁珠全部混匀。

C、转移U型板到磁力架上放置约5min。

D、转移上清到一个新的Nuclease-free管中。

7、保存aRNA在-20oC以下的温度或者放在冰上进行定量和片断化。

第四章杂交、洗涤、染色、扫描芯片

五、片断化

1、准备aRNA片断化混合液。

表5.1

2、片断化反应。

A、94oC反应35min。

B、反应结束后立即放置冰上。

3、电泳检测片断化产物片段大小，约为35~200nt。

4、立即进行杂交实验或冻存。

六、杂交

1、按照下表根据杂交芯片种类准备杂交液。

表6.1

2、在室温平衡芯片。

3、99oC加热杂交液5min。

4、同时加适量（见表6.2）预杂交液到芯片。

表6.2

5、芯片预热10min。

6、杂交液99oC加热后，45oC放置5min。

7、最大速度离心杂交液5min。

8、加杂交液到芯片里，45oC，60rpm杂交16h。

七、洗涤、染色和扫描

1、准备好洗涤工作站和扫描仪。

2、分别分装600μLstain1，600μLstain2，800μLArrayHoldingBuffer，放置到洗涤工作站的相应位置。

3、选择相应的洗涤程序，按下软件开始洗涤染色按钮进行洗涤染色芯片。

4、芯片洗涤染色后放进扫描仪，按下软件开始扫描按钮进行扫描芯片。