利用 Ambion 的 MicroPoly(A)Pure 试剂盒分离 mRNA 实验

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

乙醇,100%

2.特殊设备

组织均化器（可选），见二、方法步骤4

水浴，预设到70°C

3.其他

MicroPoly(A)Pure试剂盒（Ambion)

4.细胞和组织

原始细胞

二、方法

1.将洗脱缓冲液预热到70°C。

2.250g离心沉降细胞后移弃上清液。

3.在PBS中溫和重悬后离心，对细胞沉降物进行第一次洗涤。弃上清液。

4.加250ul裂解液。用组织均化器或通过剧烈振荡或抽吸进行均质化。估计裂解产的体积，以作为「起始体积」。

5.加2倍起始体积的稀释缓冲液。倒置或摇动10s进行混合。

6.4°C下12000g离心15min。将上清液转至一新管中。

7.向样品中加一小瓶oligo(dT)纤维素。倒置混合。室温下轻柔搅动温育30~60min。

8.室温下4000g离心3min。

9.转移上清液，保存上清液直到实验证明有mRNA被纯化出来。

10.向寡脱氧胸苷酸纤维素沉降物中加1ml结合缓冲液，倒置混合，4000g离心3min,弃结合缓冲液，重复该步骒两次。

11.向沉降物中加lml洗涤缓冲液，倒置混合，4000g离心3min移弃洗涤缓冲液并重复该步骤两次。

12.将一离心柱放入洗涤管中，在400ul洗涤缓冲液中重悬oligo(dT)纤维素。将溶液转移到离心套柱中并于4000g短暂离心，弃流过物。

13.向离心套柱加500ul洗涤缓冲液。用一移液管头混合树脂，小心避免破坏柱中的膜。室温下短时离心，弃流过物并重复该步骤。保存最后一次洗涤的流过物。

14.确定流过物的A₂₆₀。如A₂₆₀小于0.05，继续进行方案；如A₂₆₀大于0.05,重复用500ul洗涤缓冲液进行洗涤，直到A₂₆₀小于0.05。

15.将离心套柱放入一新的微量离心管，向离心套柱加100ul70°C的洗脱缓冲液，立即于5000g离心。向离心套柱另加100ul热的洗脱缓冲液并于5000g短暂离心。弃离心套柱。

16.将20ul5mol/L的醋酸铵、1ul糖原和550ul的100%乙酵加到洗脱的mRNA中，-20°C沉淀过夜。

17.4°C下大于或等于12000g离心20min回收mRNA。

18.小心移弃上清液，再次短暂离心，用一尖头移液管移弃所有残液。

19.将沉降物再溶解于1~20ul由试剂盒提供的经DEPC处理的H₂O/EDTA中剧烈振荡彻底溶解沉降物。于-70°C储存RNA。