Pierce ECL Western blotting substrate免疫印迹化学发光试剂

免疫印迹化学发光试剂（ECL Reagent） 　

用途：

　　本试剂是非***性发光系统，用于检测固定在膜上的蛋白，其敏感性达1-10pg。用X光片可快速地获得永久的硬拷贝结果。所含独特的底物足以维持数小时的发光，便于反复曝光操作，免疫印迹膜经抗体脱卸处理后可供再次抗体探查使用。

原理：

　　辣根过氧化酶使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。在免疫印迹中，将复杂的蛋白混合物经SDS-PAGE分离，并转移到固相膜上（如NC、PVDF）等，用于免疫学检测，经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接（标记一抗）或间接（标记二抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此光可经X光片（***自显影片）感光记录下来。

操作注意：

1. 本试剂每个批号均独立优化，请不要混用或稀释本试剂以免降低敏感性；

2. 加入一抗某膜不能再干燥；

3. 适当地封闭和洗涤膜片至关重要；

4. 使用前配置化学发光试剂，配置两足够覆盖膜片即可，弃去使用过的混合试剂；

5. 使用干净取样头取用每种试剂；

6. 第一张片子建议曝光30秒钟，观察结果后判断最佳曝光时间可从30秒至2小时不等；

7. 除了***自显影片曝光和洗片处理外，所有步骤均不必在暗室中操作；

8. 膜片可经适当方法洗脱原有抗体，再次印迹使用，在此情况下，此试剂更为理想；

9. 因为它不象生色物质需要从膜片上清除底物。

使用方法：

I. 印迹膜制备 按常规方法完成SDS-PAGE和电转膜操作，适当的封闭非常重要。可以通过标记一抗或二抗的手段引入HRP，一般采用市售的HRP二抗交联物。仔细地淋洗对于降低背景非常重要，在与HRP交联物温育后，膜片更需仔细洗涤，所有步骤均在室温下完成。

II. 化学发光试剂的配置 在使用前等量混合A液和B液，混合后尽快使用。将膜片置混合液中于室温下振荡温育1分钟，每平方厘米膜片至少使用0.125ml以覆盖全膜片。

III. 蛋白信号显现1. 用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸以吸去过量试剂。

2. 置膜片于二层保鲜膜之间，小心赶尽气泡。

3. 将膜片吸附蛋白面朝上，置于X光片盒中。

4. 于暗室中压上X光片。

5. 曝光30秒，显影之。

6. 调节曝光时间，再次曝光显影。

IV、膜的重复使用：

配置62.5mM Tris-Hcl,PH6.7,2%SDS, 7ml/100ml的***的溶液，胶片放入后，70?C振荡水浴30分钟。再用TBST或PBST缓冲液洗脱，最后用BSA（牛血清白蛋白）或牛奶封闭。

免疫印迹化学发光检测流程

电泳分离样品蛋白

↓

转移至固相膜

↓

封闭非特异结合位点

↓

与第一抗体温育反应

↓洗涤

与HRP-第二抗体交联物温育反应

↓洗涤

等量混合溶液A和溶液B↓

与膜片温育

↓

X光片曝光显影

订货信息：

　　￥480.00