活体小鼠基因编辑原来可以如此简单

CRISPR/Cas9 已经成为基因编辑的明星技术，但该技术在体内应用仍然受到诸多限制，比如：使用 Cas9 系统进行组织或细胞特异性基因编辑时，时机和范围难以控制；研究一个或几个基因功能时，需专门制作相应的模型；使用病毒载体进行活体感染时，Cas9 表达框过大从而超过病毒装载容量，限制了其应用。

2014 年 10 月 9 日，Cas9 技术大牛 Zhang Feng 博士的研究团队制作了一个条件性表达 Cas9 蛋白的小鼠，相关工作成为 Cell 封面文章 （Platt et al., 2014）：在 Rosa26 基因位点定点插入 CAG 启动子驱动的 Cas9 表达框，同时以 loxP-STOP-loxP（LSL）阻断 Cas9 的表达，表达 Cre 去除 STOP 元件后可开启 Cas9 表达；Cas9 融合了 EGFP 后可在细胞及组织中的示踪 Cas9 的表达（图一）；采用该模型时，以装载 Cre 表达元件及针对靶基因 sgRNA 的病毒感染目的组织或器官后，即可实现组织特异性基因编辑。为验证此模型的有效性，作者通过慢病毒感染在小鼠骨髓树突细胞中实现了 Myd88 和 A20 的敲除；并用一个名为「KPL」的 AAV（腺相关病毒）载体在肺部敲除了 p53/LBK1 并同时 Kras-G12D 点突变，成功制备肺癌发病模型（图二）。同时作者亦证实，Cas9 蛋白全身持续过表达，未对小鼠产生不利影响 （Platt et al., 2014）。

图一条件型表达 Cas9 的小鼠敲入策略 （Platt et al., 2014）

图二表达 Cre 及 sgRNA 的病毒载体 （Platt et al., 2014）

鉴于表达 Cas9 蛋白的小鼠模型在模型动物制备中的潜力及优势，NBRI 自主研发成功 Rosa26 位点条件性表达 Cas9 的工具鼠（图三）：Cas9 蛋白整合了红色荧光标记 tdTomato,同时为避免 Neo 标记残留对小鼠表型的干扰 （Colledge et al., 1995; Meyers et al., 1998; Olson et al., 1996; van der Hoeven et al., 1996），我们提供的小鼠已去除 Neo 标记，因此可保证 Cas9 在小鼠体内稳定高效的表达。

图三 NBRI rosa26-LSL-Cas9-tdTomato 小鼠

目前南京大学-南京生物医药研究院已经成功研发了 Rosa26-LSL-Cas9-tdTomato 小鼠模型，该模型极大降低了制备基因编辑小鼠模型的技术门槛：您可以根据研究需求，自己制备特定组织或器官实现基因编辑的模型，无须依赖专业公司的模型定制服务，在节约实验成本的同时增加了模型制备的灵活性。如果您对这种小鼠模型感兴趣，欢迎联系我们，衷心希望 NBRI 的模型小鼠能为您的研究增添助力。

参考文献

Colledge, W.H., Abella, B.S., Southern, K.W., Ratcliff, R., Jiang, C., Cheng, S.H., MacVinish, L.J., Anderson, J.R., Cuthbert, A.W., and Evans, M.J. （1995）。 Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature genetics 10, 445-452.

Meyers, E.N., Lewandoski, M., and Martin, G.R. （1998）。 An Fgf8 mutant allelic series generated by Cre- and Flp-mediated recombination. Nature genetics 18, 136-141.

Olson, E.N., Arnold, H.H., Rigby, P.W., and Wold, B.J. （1996）。 Know your neighbors: three phenotypes in null mutants of the myogenic bHLH gene MRF4. Cell 85, 1-4.

Platt, R.J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M.J., Swiech, L., Kempton, H.R., Dahlman, J.E., Parnas, O., Eisenhaure, T.M., Jovanovic, M., et al. （2014）。 CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell 159, 440-455.

van der Hoeven, F., Zakany, J., and Duboule, D. （1996）。 Gene transpositions in the HoxD complex reveal a hierarchy of regulatory controls. Cell 85, 1025-1035.