活体小鼠基因编辑原来可以如此简单

CRISPR/Cas9已经成为基因编辑的明星技术，但该技术在体内应用仍然受到诸多限制，比如：使用Cas9系统进行组织或细胞特异性基因编辑时，时机和范围难以控制；研究一个或几个基因功能时，需专门制作相应的模型；使用病毒载体进行活体感染时，Cas9表达框过大从而超过病毒装载容量，限制了其应用。

2014年10月9日，Cas9技术大牛ZhangFeng博士的研究团队制作了一个条件性表达Cas9蛋白的小鼠，相关工作成为Cell封面文章（Plattetal.,2014）：在Rosa26基因位点定点插入CAG启动子驱动的Cas9表达框，同时以loxP-STOP-loxP（LSL）阻断Cas9的表达，表达Cre去除STOP元件后可开启Cas9表达；Cas9融合了EGFP后可在细胞及组织中的示踪Cas9的表达（图一）；采用该模型时，以装载Cre表达元件及针对靶基因sgRNA的病毒感染目的组织或器官后，即可实现组织特异性基因编辑。为验证此模型的有效性，作者通过慢病毒感染在小鼠骨髓树突细胞中实现了Myd88和A20的敲除；并用一个名为「KPL」的AAV（腺相关病毒）载体在肺部敲除了p53/LBK1并同时Kras-G12D点突变，成功制备肺癌发病模型（图二）。同时作者亦证实，Cas9蛋白全身持续过表达，未对小鼠产生不利影响（Plattetal.,2014）。

图一条件型表达Cas9的小鼠敲入策略（Plattetal.,2014）

图二表达Cre及sgRNA的病毒载体（Plattetal.,2014）

鉴于表达Cas9蛋白的小鼠模型在模型动物制备中的潜力及优势，NBRI自主研发成功Rosa26位点条件性表达Cas9的工具鼠（图三）：Cas9蛋白整合了红色荧光标记tdTomato,同时为避免Neo标记残留对小鼠表型的干扰（Colledgeetal.,1995;Meyersetal.,1998;Olsonetal.,1996;vanderHoevenetal.,1996），我们提供的小鼠已去除Neo标记，因此可保证Cas9在小鼠体内稳定高效的表达。

图三NBRIrosa26-LSL-Cas9-tdTomato小鼠

目前南京大学-南京生物医药研究院已经成功研发了Rosa26-LSL-Cas9-tdTomato小鼠模型，该模型极大降低了制备基因编辑小鼠模型的技术门槛：您可以根据研究需求，自己制备特定组织或器官实现基因编辑的模型，无须依赖专业公司的模型定制服务，在节约实验成本的同时增加了模型制备的灵活性。如果您对这种小鼠模型感兴趣，欢迎联系我们，衷心希望NBRI的模型小鼠能为您的研究增添助力。

参考文献

Colledge,W.H.,Abella,B.S.,Southern,K.W.,Ratcliff,R.,Jiang,C.,Cheng,S.H.,MacVinish,L.J.,Anderson,J.R.,Cuthbert,A.W.,andEvans,M.J.（1995）。GenerationandcharacterizationofadeltaF508cysticfibrosismousemodel.Naturegenetics10,445-452.

Meyers,E.N.,Lewandoski,M.,andMartin,G.R.（1998）。AnFgf8mutantallelicseriesgeneratedbyCre-andFlp-mediatedrecombination.Naturegenetics18,136-141.

Olson,E.N.,Arnold,H.H.,Rigby,P.W.,andWold,B.J.（1996）。Knowyourneighbors:threephenotypesinnullmutantsofthemyogenicbHLHgeneMRF4.Cell85,1-4.

Platt,R.J.,Chen,S.,Zhou,Y.,Yim,M.J.,Swiech,L.,Kempton,H.R.,Dahlman,J.E.,Parnas,O.,Eisenhaure,T.M.,Jovanovic,M.,etal.（2014）。CRISPR-Cas9knockinmiceforgenomeeditingandcancermodeling.Cell159,440-455.

vanderHoeven,F.,Zakany,J.,andDuboule,D.（1996）。GenetranspositionsintheHoxDcomplexrevealahierarchyofregulatorycontrols.Cell85,1025-1035.