双室体描仪测定豚鼠气道阻力和气道反应性

建立应用双室体描仪测定豚鼠气道阻力和气道反应性的方法，为哮喘的研究提供有效手段。

方法：应用双室体描仪分别测定乙酰甲胆碱(Mch)激发后豚鼠气道阻力的回复时间；于实验的第1、15天分别测定正常对照组豚鼠气道阻力和气道反应性2次，每次间隔2h，验证测定结果的重复性；观察OVA致敏豚鼠OVA激发前后气道阻力和气道反应性的变化情况。结果 PC₁₀₀浓度的Mch雾化后，豚鼠在1h内气道阻力回到基线水平。正常对照组豚鼠在第1、15天分别测量两次的基础气道阻力sRaw为(3.25±0.67)cmH₂O·s、(3.33±0.58)cmH₂O·s、(3.30±0.56)cmH₂O·s、(3.32±0.75)cmH₂O·s，气道反应性(log2PC₁₀₀)值分别为8.48±0.94、8.64±1.04、8.56±0.67、8.64±0.60，气道阻力和气道反应性两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)。致敏豚鼠OVA激发后气道阻力和气道反应性均较激发前显著提高，sRaw分别为(7.08±1.82)cmH₂O·s和(2.87±0.53)cmH₂O·s(P<0.01)，log2PC₁₀₀值分别为6.64±1.26和8.48±1.17(P<0.01)。结论成功建立了应用双室体积描记法测定豚鼠气道阻力和气道反应性的实验方法。

关键词：体描仪；气道阻力；气道反应性；豚鼠
豚鼠容易致敏，能产生Ⅰ型和Ⅳ型变态反应，是最常用的构建哮喘模型的动物之一。但国内文献所构建的豚鼠哮喘模型往往缺少气道反应性等呼吸生理指标，严格来说，只能算是豚鼠变应性气道炎症模型。气道高反应性(AHR)是支气管哮喘的基本特征之一，要阐明哮喘的发病机制，必然要研究AHR的机制。本研究在国内率先应用双室体描仪测定豚鼠的气道阻力和气道反应性，旨在建立一种简便的可重复的测定气道反应性的方法，为哮喘的研究提供有效的手段。

1 材料和方法

1.1 材料
乙酰甲胆碱(Methacholine，Mch)、鸡卵白蛋白(OVA)、氢氧化铝购自Sigma公司；盐酸苯海拉明(天津药业集团)；便携式超声波雾化吸入器(粤华仪器厂)；双室体描仪(美国BUXCO公司)；微量超声雾化器(美国Aerogen公司)。

1.2 动物及分组
普通级纯白Hartly豚鼠26只，体质量(400±50)g，雄性，购自广东省实验动物中心，随机分为3组。正常对照组A：8只豚鼠，应用系列浓度Mch雾化豚鼠直至PC₁₀₀(雾化某一浓度的Mch后，气道阻力较基础气道阻力上升100%或以上，即停止雾化Mch，该浓度即为PC₁₀₀)，然后观察气道阻力回复至基线水平所用时间。正常对照组B：12只豚鼠，在第1、15天各分别两次测豚鼠的气道阻力和气道反应性，每次间隔2h。哮喘组C：6只豚鼠，致敏后在OVA激发前和激发后分别测定气道阻力和气道反应性各1次，时间间隔2h。

1.3 实验方法
1.3.1 制作哮喘模型哮喘模型的制作参照文献[1]并略作改动。哮喘组豚鼠于实验第l天腹腔内注射含5%OVA和10mg/ml氢氧化铝的生理盐水混合液1ml致敏，实验第15天置豚鼠于一35cm×26cm×31cm的塑料箱中，便携式超声波雾化吸入器雾化吸入1%OVA生理盐水溶液2min，以诱发豚鼠哮喘发作，雾化速度为1.3ml/min。雾化诱喘前10min豚鼠按4mg/kg腹腔注射盐酸苯海拉明，以抑制可能发生的超敏反应。
1.3.2 气道阻力和气道反应性的测定方法双室体描仪由头室和体室组成，各置一流量传感器，分别用于测量鼻部呼吸引起的气流变化和胸廓运动引起的气流变化。流量传感器感受到的流量变化转变成电信号，经放大器放大，转换成数字信号后，通过软件(BioSystemXAsoftwarewithNAManalyzer)分析，计算出豚鼠气道阻力(specificairwayresistance，sRaw)。豚鼠颈部套上3个大小适中的橡胶项垫，起到固定豚鼠及保持两室之间相对密闭的作用。置豚鼠于体描仪中，等豚鼠安静5min后，动态测定sRaw。依次用微量超声雾化器雾化生理盐水、25、50、100、200、400、800、1600mg/LMch30s，雾化速度为0.2ml/min，雾化完30s后监测sRaw2min。若sRaw上升较基础sRaw上升小于100%，即雾化下一浓度。当雾化某一浓度的Mch后，sRaw较基础sRaw上升100%或以上，确定这一Mch浓度为PC₁₀₀。此时即停止雾化Mch。某豚鼠的PC₁₀₀值越大，证明此豚鼠的气道反应性越低。

1.4 统计学处理
采用SPSS11.0统计软件进行分析，各豚鼠所测得的PC₁₀₀值进行log2数值变换。各指标(计量资料)用均数±标准差表示，显著性检验用单因素方差分析。组间比较用LSD(方差齐时)或TamhanesT₂(方差不齐时)；OVA致敏豚鼠OVA激发前后气道阻力和气道反应性的比较应用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 豚鼠呼吸波观察
正常对照组豚鼠呼吸波平顺，致敏豚鼠OVA激发前呼吸波和正常对照组豚鼠呼吸波形态上无明显区别；致敏豚鼠OVA激发后呼吸波高尖，频率加快，气道阻力增大。见图1、2。

图1 致敏豚鼠OVA激发前呼吸波

Fig.1 RspiratorywaveofsensitizedguineapigsbeforeOVAchallenge

图2 致敏豚鼠OVA激发后呼吸波

Fig.2 RespiratorywaveofsensitizedguineapigsafterOVAchallenge

2.2 Mch激发豚鼠后sRaw回复至基础水平所要时间
应用PC₁₀₀浓度的Mch雾化豚鼠，豚鼠的sRaw较基础阻力上升1倍后，部分豚鼠的sRaw仍可继续上升，4min后阻力逐步回落，一般30min内可以回落至基础值水平，6号豚鼠6min气道阻力即回落至基础水平，但4号豚鼠1h后气道阻力才回落至基础水平。

2.3 双室体描仪测量豚鼠sRaw和气道反应性测量结果的重复性
正常对照组B豚鼠在第1、15天分别测量两次基础气道阻力sRaw为(3.25±0.67)cmH₂O·s、(3.33±0.58)cmH₂O·s、(3.30±0.56)cmH₂O·s、(3.32±0.75)cmH₂O·s，4个时间点测量的气道阻力两两比较，差异没有统计学意义(P>0.05)。相对应测量豚鼠的4次的气道反应性(log2PC₁₀₀)值分别为8.48±0.94、8.64±1.04、8.56±0.67、8.64±0.60，其值两两比较，差异没有统计学意义(P>0.05)。此说明应用双室体描仪测量豚鼠sRaw和气道反应性的重复性良好，可对豚鼠进行这两项指标的动态多次检测。

2.4 验证豚鼠的哮喘模型
哮喘模型组豚鼠OVA激发前后sRaw分别为(2.87±0.53)cmH₂O·s和(7.08±1.82)cmH₂O·s(P<0.01)，说明豚鼠OVA激发后气道阻力高于OVA激发前气道阻力。OVA激发前后log2PC₁₀₀值分别为8.48±1.17和6.64±1.26(P<0.01)，说明豚鼠OVA激发后气道反应性高于OVA激发前。从呼吸生理的角度看，应用双室体描仪测定sRaw和气道反应性，能有效地验证豚鼠的哮喘模型。

3 讨论

体积描记法是一种无创的测定气道阻力和气道反应性的方法，操作简单，可进行多次测量，便于进行自身对照研究，目前在国外得到较为广泛的应用。整体体积描记法由Jacky[2]首先报道。其允许动物自由活动、进食、饮水，操作容易，可测定时间长。但应用整体体积描记法测定sRaw的准确性却受到一些学者的质疑[3][4][5]。双室体积描记法由Johanson[6]首先报道，1979年Pennock[7]应用于豚鼠气道阻力的测定。由于国内条件有限，应用体积描记法测量动物的肺功能少有报道[8]。

豚鼠容易致敏，能产生Ⅰ型和Ⅳ型变态反应，特别适合于制作过敏性哮喘动物模型。但国内文献所构建的豚鼠哮喘模型往往缺少呼吸生理的功能指标，严格来说，只能算是豚鼠变应性气道炎症模型。所以有必要对这种“变应性气道炎症”进行肺功能的测定以证实哮喘模型的构建成功。同时这种呼吸生理功能的测定，利于观察药物等干预手段的效果，利于对哮喘发病及诊疗机制的探讨。本实验室在国内首次购进美国BUXCO公司的双室体描仪对豚鼠的sRaw和气道反应性进行了测定。双室体积描记系统包括体积描记箱
(Plethysmograph)、超声雾化器(UltrasonicNebulizer)及雾化调节系统、前置信号放大器(MAXIIpreamplifierunit)、信号处理系统(BioSystemXAforWindowssoftware)等几部分。体积描记箱由头室(用于测量鼻部气流的变化)和体室(用于测量胸腔气流的变化)构成，每一室均连接一个流量传感器以测定室内的呼吸流量变化。其工作原理是根据鼻腔比胸腔的气流滞后时间dT来计算气道阻力sRaw。由于先有胸廓的运动才会产生气体进出体内的过程，鼻部的气流滞后于胸部的气流产生时差dT，当sRaw增加时，鼻部气流与胸部气流的相位差会增加。根据公式：sRaw=[(T_I+T_E)/(2π)×(P_atm-47)×1.36×2π×dT/(T_I+T_E)](公式中P_atm代表大气压，T_I代表吸气时间，T_E代表呼气时间)，通过软件(BioSystemXAsoftwarewithNAManalyzer)分析，可以计算出sRaw，从而了解动物的气道阻力情况。实验所得数据显示，PC₁₀₀浓度的Mch雾化豚鼠后，豚鼠的sRaw在几分钟内仍可上升，在1h内阻力回到基线水平。要排除测定中应用Mch激发会对下一次sRaw的测定造成影响，两次测定sRaw的时间间隔应该在1h以上，所以为了验证双室体描仪测量豚鼠sRaw和气道反应性测量的重复性，实验第1、15天重复测定正常对照组豚鼠各1次，同一天的测量时间间隔选取为2h。结果显示各次的气道基础阻力和气道反应性无明显差异，证明应用双室体积描记法测定豚鼠的气道基础阻力和气道反应性的重复性良好。本实验结果表明，OVA致敏豚鼠激发后sRaw和气道反应性较激发前均显著提高，证明OVA致敏及激发豚鼠是简单有效的构建哮喘模型的方法，双室体积描记法的应用为哮喘研究提供了有效的手段。

参考文献：
[1]周林福,殷凯生.小剂量三（3）氧化二（2）砷对哮喘豚鼠气道嗜酸细胞凋亡和核因子κB表达作用的相关性[J].中华结核和呼吸杂志,2002,25(7):439.
   [2]JackyJP.Aplethysmographforlong-termmeasurementsofventilation inunrestrainedanimals[J].JApplPhysiol,1978,45(4):644-7.
   [3]PetakF,HabreW,DonatiYR,etal.Hyperoxia-inducedchangesinmouselungmechanics:forcedoscillationsvs.barometricplethysmography[J].JApplPhysiol,2001,90(6):2221-30.
   [4]LundbladLK,IrvinCG,AdlerA,etal.Areevaluationofthevalidityofunrestrainedplethysmographyinmice[J].JApplPhysiol,2002,93(4):1198-207.
   [5]MitznerW,TankersleyC.InterpretingPenhinmice[J].JApplPhysiol,2003, 94(2):828-31.
   [6]JohansonWGJr,PierceAK.Anoninvasivetechniqueformeasure-mentofairwayconductanceinsmallanimals[J].JApplPhysiol,1971,30(1):146-50.
   [7]PennockBE,CoxCP,RogersRM,etal.Anoninvasivetechniqueformeasurementofchangesinspecificairwayresistance[J].JApplPhysiol,1979,46(2):399-466.
   [8]宋建勇,任渝祥,林辉,等.用PKC抑制剂Rottlerin治疗小鼠实验性哮喘的研究[J].第三军医大学学报,2003,25(16):1411-4.

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