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| 实验材料 | 适用于杯状DNA的S30提取物适用于线状DNA的S30提取物适用于环状DNA的T7S30提取物 试剂、试剂盒 | 无核酸酶的水[35S]标记的甲硫氨酸1mmolL缺少中硫氨酸的氨基酸混合物缺少氨基酸的S30反应混合液 仪器、耗材 | —70℃冰箱微量移液器离心机冰浴
实验步骤 | ―、材料与设备 1)无核酸酶的水。 2)[35S]标记的甲硫氨酸（1.25×10-5mol/L12000Ci/mmol) 3）1mmol/L缺少中硫氨酸的氨基酸混合物 4)缺少氨基酸的S30反应混合液（Promega公司） 5)适用于杯状DNA的S30提取物（Promega公司） 6)适用于线状DNA的S30提取物(Promega公司） 7)适用于环状DNA的T7S30提取物(Promega公司） 8)—70℃冰箱 9)微量移液器 10)离心机 11)冰浴 二、操作方法 (一）适用于对环状DNA进行体外翻译的大肠杆菌S30提取物系统 2）轻轻涡旋，然后离心5s,以使反应混合物沉入管底。 3)37℃孵育1〜2h。 4)将反应管置于冰浴上5min,以终止反应。 5)分析试验结果。利用三氯乙酸（TCA)免疫沉淀实验和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以分析产物， (二）适用于对线状DNA进行体外翻译的大肠杆菌S30提取物系统 具体操作步骤同「(一）适用于对环状DNA进行体外翻译的大肠杆菌S30提取物系统」中的1)〜5)。反应体系如表4.2所示 (三)适用于对环状DNA迸行体外翻译的大肠杆菌T7S30提取物系统 具体操作步骤同「一）适用于对环状DNA进行体外翻译的大肠杆菌S30提取物系统」中的1)〜5)，反应体系如表4.3所示； 注意事项 | 1)DNA用量的优化。逋常，一个反应体系屮不应包含超过4ug的DNA。因为随DNA的不断增加将会导致较多的未掺入标记氨基酸的目的蛋白的产生、从序列内部起始翻译反应的增加以及过¥结朵翻译的产物的不断增加。 2)因为S标记的氨基酸极易被鉍化成亚砜类而失去活性，故应将[35S]标记的甲硫氨酸分装后保存于一70℃,每次融化后使用，以取得最好的反应结果。 3)模板DNA和水的纯度是非常重要的。如果翻译效率低下，则应检查水与模板的纯度。 4)反应可在24〜37℃的温度范闱内进行，37°C时反应速度最快，需时约2h。较低的温度会导致较低的催化速率，且反应时间会相应延长数小时。假如在37°C反应lh没冇产牛预期的结果，则应尝试在低温反应较长的时间，这样有利于增加蛋白的表达量和蛋白表达的特异性。 新闻动态
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