具有AAV2/5包装功能的重组单纯疱疹病毒的研制

构建基于HVS的重组载体

材料

试剂
牛血清白蛋白（BSA;10%)

细胞：ElectromaxDHlOB细胞（Invitrogen);OMK细胞

氯霉素（50ull/ml)

DMEM补充如下物质：

2mmol/L谷氨酰胺

0.1%(m/V)碳酸氢钠

200U/ml青霉素

200U/ml链霉素

胎牛血清（FBS)

葡萄糖（20%和40%m/V)溶于PBS中

以孔径为0.2um的滤膜过滤。

Ppol限制酶和缓冲液（Promega).

卡那霉素（25ul/ml)

Lipofectamine2000(Invitrogen)

LB培养基（pH7.5)

1%(m/V)蛋白胨

0.5%(m/V)酵母提取物

0.5%(m/v)氯化钠

氯化镁（l〇mmol/L)

PBS缓冲液

质粒：HVS——BAC和pHVS^Shuttle

QIAquick凝胶回收试剂盒

病毒悬浮缓冲液

100mmoI/LTris-HCl(pH8.0)

50mmol/LNACl

10mmol/LEDTA

仪器

BeckmanSW27离心机

烧瓶（75cm3)

梯度混合器

LB琼脂培养平板(14cm)

Maxiprep柱（QIAGEN)

滚瓶

方法

1•将外源基因表达片段（包含合适的启动子、基因片段、多聚腺苷酸化信号）插入到穿梭质粒pHVS——Shuttle中。

2.用I-Pp0I酶切，将这个基因的表达框和卡那霉素抗性基因片段从pHVS——Shuttle上分离出来。

I-PpoI酶切反应是在加入IXBSA和10mmol/LMgCl2的lXI-PpoI酶切缓冲液中进行。

3.依照产商说明书，用QIAquick凝胶回收试剂盒纯化目的片段。

4.用5〜IOul的1-PpoI酶切使得HVS^BAC线性化。

5.65°C处理20min,热失活对穿梭质粒和HVS^BAC的酶切。

6•将HVS^BAC的酶切产物在蒸馏水（dH20)中透析2h。

7.连接线性化的HV&BAC和穿梭质粒片段，标准条件下16°C连接过夜。

3ul的HVS^BAC与IfI的穿梭质粒酶切片段，在IOfJ的连接体系中进行连接，按照这样的比例通常可以得到较好的结果。具体的量可以根据提纯的DNA的质量和数量而定。

8.将连接产物在蒸馏水（dH20)中透析2h。

9•用电穿孔法将无盐的连接产物导人到20ul的ElectromaxDHlOB菌体中。

10.加人400W的LB培养液，使菌体复苏。

11.37°C下，摇晃（lOOr/min)孵育lh。

12.将电转导后的细胞涂在含有LB琼脂培养基、卡那霉素（50ug/ml)和氯霉素(25ug/ml)的平板（直径Mcm)上，过夜。

I3•按照产商提供的低拷贝质粒的提取方法，用Maxiprep柱从形成的菌落中提取和纯化重组的HVS^BACDNA。

14.按照产商说明，用Lipofectamine2000将2哗的纯化HVS——BACDNA转人到OMK细胞中。

15•将转染后的细胞在DMEM培养基中孵育4〜5d，直至出现明显的细胞毒性。

16•使子代病毒释放到胞外的培养液中。

病毒工作储存液的生长

最适于HVS病毒裂解感染和生长的细胞系是在含有1〇%FBS的DMEM培养基中培养的OMK细胞。

17•将IXlO⁷个细胞接种于75cm3的细胞培养瓶中，使细胞生长至汇合。

18.在5ml含有2%FBS的DMEM培养基中，以每个细胞〇.1个蚀斑形成单位(0•lpfu/cell)的感染复数感染细胞。

19.在37°C感染Ih后，吸出培养液。

20.加人IOml含有5%FBS的DMEM培养基，在37°C下培养4〜5d。

21.当观察到出现细胞毒性时，释放子代病毒到胞外的培养液中。
HVS的工作储存液可以2X10s——2X107pfu/ml的最终浓度，在一70℃下长期保存。如仅需中期保存，HVS能在4°C保持稳定。

高滴度病毒的生长和纯化

22.将约2X10⁸个OMK细胞接种于滚瓶中，用含有10%FBS的DMEM培养基培养。

23•以约0.5pfu/个细胞的感染复数感染细胞。孵育4〜5d。

24•分离细胞，收集细胞培养液。

25.用带BeckmanSW27转头的离心机，4°C下，将悬浮液于20000r/min离心90min。

26•用病毒重悬缓冲液将沉淀重悬，每两个转瓶约使用3ml的重悬缓冲液。4°C下过夜。

27.用梯度混合器，准备20%〜40%的葡萄糖浓度梯度。在浓度梯度中使重悬的病毒分层。

28•用带BeckmanSW27转头的离心机，4°C下，于20OOOr/min离心30min。

29•收获中间的条带，这条带中包含约90%的包装的病毒颗粒。

30•用带BeckmanSW27转头的离心机，4°C下，于25OOOr/min离心60min。用PBS重悬沉淀。