用于基因传递的聚赖氨酸共聚物一质粒 D N A 的体外转染

质粒DNA的体外转染

材料

试剂

A7R5细胞，鼠平滑肌细胞系（AmericanTypeCellCulture[ATCC])

用含10%胎牛血清的DMEM(Dulbeccominimalessentialmedium)培养基在37。0.5%

CO2的培养箱中培养。

生长培养基和胎牛血清（FBS)(HyCloneLaboratories)

邻硝基苯基-卩-D■半乳糖吡喃糖苷（ONPG)

磷酸盐缓冲液（PBS)

质粒DNA，pSV-p-glactosidase对照载体（6821bp,Promega)

terplex复合物

通过改变PLL或LDL制备不同的复合物。室温下，在PBS溶液中混合十八烷基化PLL[通过硬酯溴AT-烷基化PLL(M.W.50000)合成]和不同量的LDL(更详细的内容请参考Kimetal.1998b)。

仪器

细胞培养箱，控制在5%C02(如Napco,PrecisionScientific)

分光光度计

方法

1.在转染前一天，在24孔板以2XIO⁴个/ml的浓度接种A7R5细胞，在37°C，5%
CO2下培养。

2.固定质粒DNA的用量，在PBS溶液中将DNA与含有各种成分的terplex混合，并使24孔板每孔用于一次转染的DNA用量为lug。

最好在转染前新鲜制备！

3•在每孔中加入40ulDNA溶液（作为对照）或含PLL、LDL和质粒DNA的terplex。

4•在37°C，5%.C〇2的条件下培养细胞48h,经PBS溶液洗涤3次，收集细胞用于检测β-半乳糖苷酶活性。

5•以ONPG为底物，用分光光度计在420nm检测转染细胞的β-半乳糖苷酶活性。

寡核苷酸DNA的体外转染

材料

试剂

A7R5细胞，鼠平滑肌细胞系（AmericanTypeCellCulture[ATCC])

用含10%胎牛血清的DMEM(Dulbeccominimalessentialmedium)培养基在37°C，5%C〇2的培养箱中培养。

CCD-32Lu，人肺纤维原细胞系（ATCC)

用含10%胎牛血清的EMEM(Eagle’sminimalessentialmedium)培养基在25mm2的聚苯乙烯组织培养瓶（T-25培养瓶，Falcon)培养。胰蛋白酶消化，重悬用于实验。

生长培养基和胎牛血清（FBS)(HyCloneLaboratories)

MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl3-2,5-diphenyltetrasodiumbromide)CSigmaAldrich)

寡核苷酸
rmyb反义寡核苷酸（I8mer，5^GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3’)搭配不当（mismatched)反义寡核苷酸（18mer，5‘-GTCTCCGGCTCACCCGG〇3，）

反义寡核苷酸由MidlandCertifiedReagentCo•通过亚憐胺化学法合成，并通过凝胶过滤纯化

terplex复合物

通过改变寡核苷酸的用量制备不同的复合物。

室温下，在PBS溶液中混合十八烷基化PLL[通过硬酯溴N-烷基化PLLOVLW.50000合成]和固定量的LDL，以及变化量的寡核苷酸，来制备稳定的terplex复合物（更详细的内容请参考Kimetal.1998b)。

仪器

细胞培养箱，控制在5%C〇2(如Napco，PrecisionScientific)

方法

1.在转染前一天，以5X10⁴个细胞/孔的密度在96孔板接种A7R5或CCI>32Lu细胞，在37°C，5%CO2浓度下培养过夜。

2.通过改变寡核苷酸DNA的量制备不同terplex复合物。

最好在转染前新鲜制备！

3.将terplex复合物加人到培养的细胞，在37℃，5%C02下培养细胞4h，包括含血清和不含血清两种情况。

4•利用MTT法分析细胞增殖的情况（Mosmann1983)。

体内动物实验

材料

试剂

丁丙诺啡（buprenorphine)

异氟焼Gsoflurane)

克他命（ketamine)(50mg/kg，肌肉注射）

磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4)

质粒DNA，pCMV-VEGF

质粒DNA通过双CsCl梯度纯化，并通过A26qM28。和0.8%琼脂糖凝胶电泳确认。

兔，NewZealandWhite(2.5〜3.5kg)(WestemOregon)

染色溶液

苏木精和曙红（hematoxylinandeosin，H&E)

trichrome

甲苯噻嗉（xylazine)(8.8mg/kg，肌肉注射）

仪器

血管插管（angiocatheter)

心电图扫描仪

针头（30号)

呼吸机（rodentventilator，HarvardApparatus)

Standardplanimetry软件（NIHImage)

缝合线（5-0Prolene)

超声心动图显影系统（GeneralElectricVividFiveorHewlett-Packard5500)

方法

I.给新西兰白兔喂镇静剂，选取质量在2.5〜3.5kg的白兔，肌肉注射克他命（50mg/kg)和甲苯噻嗪（8.8mg/kg)。刮掉兔子的毛并把管子插到它们的气管中。

所要准备的动物数量视研究目的确定。随机地分配这些动物到实验组或对照组（见步骤6)。

2.在无菌華件下对每只动物的左胸用异氟醚进行外科手术麻醉。将动物固定在呼吸机上，呼吸速度为60%和40%FiO2

3.将左胸廓切开，缩进肺，打开心包膜。

4•在旋动脉的第一个分支周围放置一个5-0缝合线，实施IOs闭塞测试来确定心室区域。

5.准备注射液。对于每只实验组动物，准备500ul注射液，其中含50ugLDL，50ug十八烷基化PLL和50ugpCMV-VEGF，溶于PBS(PH7.4)中。对于每只对照组动物，准备500ulPBS注射液，含50ugLDL、50ug十八烷基化PLL。

注射液最好新鲜配置。

6.在心肌内插人30号针头，分4次（每次125ul)注射准备好的注射液到每只实验动物。

7.注射后，马上按照Affleck等（2001)描述的方法诱导心肌梗死。通过目测和心电图改变判断心肌是否萎缩。

8.经过一段时间的观察后，临时封闭气体呼出，使肺部膨胀。用插管疏散胸膜内残留的空气。

9.缝合肋骨和肌肉层以及皮肤。

10.待实验动物能自然呼吸时，拔出呼吸机管。手术后48h内，每12h注射一次丁丙诺啡（0.05mg/kg，肌肉注射）止痛。

11•用克他命（20mg/kg)和甲苯噻嗪（5mg/kg)轻微麻醉兔子，在手术后的第1天和第21天记录实验动物的心电图。

在我们的研究中.，用心回波图作为处理组的盲性对照。

12•用Hewlett-Packard5500或GeneralElectricVividFive收集图像，使用12MHz的探针在我们的实验中所有的呈像均由一个有经验的超声波心动描记分析员获取，并由另一个有经验的超声波心动描记分析员进行核实，以保证不同观察者之间以及同一观察人对不同成像的之间的可靠性。胸骨右侧旁的长轴方向被用于排出量分数的二维测量。二维测量的排
出量分数通过人工记录心脏舒张期结束时和心脏收缩期结束时心室面积的变化来获得。测量时每组数据重复3〜5次，其平均值作为实验结果。胸骨右侧旁的短轴方向用于表征底部的环状结构，中等大小的乳状突起结构和顶点。M模式测量从每一水平的部分收缩变化中求得，这样就计算出了排出量分数。报道的报出量分数，部分收缩变化以及左心室收缩和舒张面积代表这些数值的平均值。

13.术后第21天，通过克他命和吸入异氟烷的方法麻醉实验班动物，放血处死。

14.用IOOml常规生理盐水从主动脉根部灌注，并将心脏经中性缓冲福尔马林加压[IOOmmHg(ImmHg=I.33322X102Pa)]灌注固定。

15.从短轴方向每5mm石蜡包封切片，苏木精和曙红染色。

16•使用Standardplanimetrysoftware(NIHIamge)测量正常的和梗死的左心室心肌
面积。
■左心室心肌梗死百分数等于左心室心肌梗死面积（所有切片）除以左心室心肌总面积，然后乘以100。