准备插入片段实验

第1阶段：DNA引物的激酶处理

研究表明很多种DNA聚合酶（比如，T7、修饰过的T7、Taq、Vent、Tth和Klenow)具有脱氧核苷酸末端转移酶（Tdt)活性（Clark1988;Hu1993)。DNA聚合酶将PCR产物3端的核苷酸延伸，这个反应具有核苷酸以及聚合酶的专一性。比如，：TaqDNA聚合酶产生的PCR产物更倾向于按下面形式修饰（+表示延伸；一表示没有添加核苷酸）。



聚合酶将碱基加到模板上可能并没有一致性的模式。因此，不能认为所有的DNA聚合酶都能够用来产生平末端DNA片段。然而，对于某些DNA聚合酶，可以通过PCR引物5端核苷酸来控制PCR产物的3端得到哪一种核苷酸（Hu1993;CostaandWeiner1994d)。利用单磷酸化载体进行定向克隆，插入片段的单磷酸化可以通过在PCR前激酶处理引物来实现。更好的办法是，在合成PCR引物时通过化学方法添加一个5磷酸基团。合成带有5-磷酸基团的PCR引物可以保证所有的单链DNA都被单磷酸化。激酶处理的优点是所有已有的各套引物都能被修饰，从而可以应用于单磷酸化载体的定向克隆。T4多聚核苷酸激酶处理是一个简单而又迅速的技术。

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

ATP(10mmol/L)

2.酶和酶缓冲液

激酶缓冲液（lmmol/L氯化镁，100mmol/LTris-HCl、pH7.5,5mmol/L二硫苏糖醇)

T4多聚核苷酸激酶（10U)

3.核酸和寡核苷酸

寡核苷酸引物（1ug/ul)

4.专用设备

两个水浴锅，预先调到37°C和95°C

二、方法

1.在离心管中加入如下成分。

激酶缓冲液，10X                            3ul

ATP，10mmol                                  0.5ul

T4DNA激酶（10U/ul)                      1ul

被选引物                                          5ug

H₂0                                                  补充到30ul

2.37°C温浴1h。

3.95°C煮沸反应体系，使T4DNA激酶失活。

第2阶段：PCR扩增

因为没有哪个操作指南指出了哪种缓冲条件可以用于各种不同类型的DNA引物-模板系统，所以通常要检测一系列的PCR缓冲液。已经有许多PCR优化试剂盒可以用来检测几种不同的缓冲液成分[比如，Opti-PrimePCR优化试剂盒（Stratagene)和ThePCROptimizer(Invitrogen)]。通过改变某些PCR缓冲液成分和利用PCR热启动酶，可以提高PCR产物的得率和特异性。另外，加入终浓度为0.8~1.6mol/L的甜菜碱，可以提高DNA的扩增效率，这是因为甜菜碱可以抑制富含GC的区域形成二级结构。

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

甜菜碱溶液，PCR级（Sigma)

dNTP储存液（包含所有的4种dNTP，每种都是100mml/L)

TE缓冲液（10mmol/LTris-HCl、pH7.5，lmmol/LEDTA、pH8.0)

2.酶和酶缓冲液

克隆用的P/mDNA聚合酶（Stratagene)

PCR缓冲液，10X(随酶一起购得）或者PCR优化缓冲液；比如，Opti-PrimePCR优化试剂盒（Stratagene)或ThePCROptimizer(Invitrogen)

热稳定的DNA聚合酶（5U);比如，TaqDNA聚合酶，TaqBead热启动聚合酶（Promega)，高保其PlatinumTaqDNA聚合酶（Invitrogen)，AmpliTaqGold(AppliedBiosystems)

3.核酸和寡核苷酸

寡核苷酸引物

模板DNA(1~50ng质粒）

4.专用设备

PCR仪

5.额外项目

琼脂糖凝胶电泳设备和试剂，包括溴化乙锭
可以选择：PCR增强剂，比如，TaqExtenderPCR添加剂（Stratagene)，PCRx增强系统（Invitrogen)

二、方法

1.冰上，在一个0.5ml(原文为ul—译者改）无菌离心管中建立25ul体系。按顺序加入如下试剂。

10XDNA聚合酶缓冲液（最终为1X)                                         2.5ul

模板DNA(1~50ng质粒或者是105~106目标分子*）              1~10ul

dNTP储存液（包含所有的4种dNTP，每种都是10mmol/L) 0.5ul

甜菜碱溶液（5mol/L)                                                                2.5ul

上游引物（4ug/ul)                                                                     0.25ul

下游引物（4ug/ul)                                                                     0.25ul

热稳定的DNA聚合酶（5U/ul)                                                   0.25ul

可选择：TaqExtenderPCR添加剂（5U)(额外的）                   0.25ul

H20                                                 补充到25ul

*对于3X105目标：1ug人单拷贝基因组DNA;10ng酵母DNA;1%的M13噬菌斑。

2.混合均匀，应该立即进行PCR扩增。

3.在一个有热盖的PCR仪上进行PCR(如果没有热盖，应该用矿物油覆盖反应体系），按下面的建议设定温度程序。



4.温度循环完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的保真性和得率。1~5ulPCR产物中的DNA片段可以在琼脂糖凝胶电泳中被溴化乙锭染色而检测出来。已知浓度的对照DNA可以用作PCR产物大小和浓度的参照。

第3阶段：用PfuDNA聚合酶抛光PCR产物的末端

为配合某些DNA聚合酶而进行的引物的优化设计在PCR中只能很少地增加平末端片段的数目。要绝对地避免使用传统的Klenow聚合酶来抛光末端，因为它还保持着相当高的外切酶活性。幸运的是，T4和PfuDNA聚合酶没有任何的DNA外切酶活性或Tdt活性，因此可以在PCR后用它们来产生平末端（见图28-4)(Hu1993;CostaandWeiner1994c，d)。



PCR抛光是用DNA聚合酶除去所有PCR产物的3端核苷酸延伸。产生的拋光分子在T4DNA连接酶的作用下可以以很高的效率和平末端克隆载体连接。在连接前拋光PCR产物的末端能够提高整个重组克隆的效率（CostaandWeiner1994c，d;Weineretal.1994)。

低于50°C时PfuDNA聚合酶基本上没有活性。这就可以让连接反应在4~25°C进行，而且在72°CPfu拋光步骤后直接进入连接反应。这就不需要在连接反应前抽提酶，而用T4DNA聚合酶拋光时就需要在连接反应前抽提酶。只要用少量的PCR产物，Pfu拋光只需30min就可以产生高保真的平末端DNA片段。下面略述了Pfu抛光的大概步骤，在PCR后可以直接进行Pfu抛光或者在PCR产物纯化后进行。

在Pfu拋光之前，最好先进行琼脂糖凝胶电泳估计一下PCR产物的大致浓度，并确定其正确性.PCR拋光只用PCR扩增反应产物的一部分，并且能够拋光体系中所有存在的DNA片段。在一个典型的25ulPCR扩增反应中，取5~10ul产物进行拋光即可。

因为常规的PCR克隆程序需要用少董的DNA插入物（1~4ul），可以直接取5~10M1PCR产物进行末端拋光反应。如果在PCR后直接逬行末端拋光反应，温度循环中剩下的dNTP和反应缓冲液足够进行拋光反应（见下面）。沉淀或凝胶回收PCR产物也可以提高末端拋光的效率，然而如果用纯化的PCR产物做末端抛光就需要加入反应缓冲液和dNTP混合物。

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

dNTP储存液（包含所有的4种dNTP，每种都是100mmol/L),方法B

2.酶和酶缓冲液

克隆化的PfuDNA聚合酶（2.5U/ul)

克隆化的Pfu缓冲液，10X(公司提供）

3.核酸和寡核苷酸

PCR产物，纯化的（方法B)和未纯化的（方法A)

4.专用设备

水浴，预先调到72°C

二、方法A—抛光未纯化的PCR产物

1.拋光PCR制备的DNA片段时，把PCR产物直接从PCR反应管中转移到一个0.5ml无菌离心管，按顺序加入以下试剂。

5~10ulPCR产物

1ul克隆化的PfuDNA聚合酶（2.5U)

加入ddH₂0至终体积为10ul

轻轻地混匀各种成分，用热盖温浴（如果没有热盖，应该用矿物油覆盖反应体系）

2.72°C温浴30min,拋光反应。

3.30min温浴后，把反应置于冰上。

4.末端拋光的DNA片段可以直接加到一个连接反应中。

三、方法B—Pfu抛光纯化过的PCR产物

1.拋光纯化过的PCR产物时，移取沉淀好的PCR产物到一个无菌0.5ml离心管，并按顺序加入下列试剂。

5~10ul沉淀PCR产物

1ul10X克隆化PfuDNA聚合酶缓冲液

1uldNTP混合物（总体是10mmol/L，每个三磷酸核苷酸是2.5mmol/L)

1ul克隆化DNA聚合酶（2.5U)

用ddH₂0补充到终体积为10ul

轻轻地混匀各种成分，在热盖中溫浴（如果没有用热盖温浴，需要用矿物油覆盖反应物）

2.72°C温浴拋光反应体系30min。

3.30min温浴完成后，把反应体系置于冰上。

4.末端拋光的DNA片段可以直接加入到连接反应体系中。

PCR产物纯化(可选择)

在进行克隆方案以前，用乙酸铵沉淀除去过剩的PCR引物，可以提高重组体的百分比。PCR产物可以按下面方案盐析出来。

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

乙酸铵，4mol/L

乙醇，100%和70%

STE缓冲液，10X(1mol/LNaCl，200mmol/LTris-HCl、pH7.5，100mmol/LEDTA)

TE(10mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)

2.专用设备

真空干燥仪

二、方法

1.加入0.1倍体积的STE缓冲液。

2.向样品中加入等体积的4mol/L乙酸铵。

3.加入2.5倍体积室温平衡过的100%乙醇。

4.立即以12000g、10min室温下离心沉淀DNA，小心倒掉上清液。

5.加入200ul70%(体积分数）乙醇。

6.以12000g、10min室温下离心，小心倒掉上清液，在其空仪中干燥沉淀。

7.用原始体积大小的TE缓冲液重悬DNA,4°C保存。