一键了解：SWATH 定量技术

SWATH（Sequential Window Acquisition of all Theoretical fragmentions）定量技术，是瑞士苏黎世联邦理工学院的 Ruedi Aebersold 博士及其团队与 AB-SCIEX 于 2012年联合推出的一项全新的质谱采集模式技术，是 MS/MSALL 技术的一种扩展。将整个质谱扫描质量范围分为若干窗口，依次对每个窗口的所有离子进行碎裂，采集全部子离子信息。该技术无需指定目标肽段，扫描点数均匀，利用谱图库即可实现定性确证和定量离子筛选，同时可实现数据回溯。SWATH可广泛应用于包括细胞，动植物组织以及蛋白复合体等蛋白质组学定性与定量。

技术原理：
以蛋白质组学样品分析中常见的扫描范围 400 ～1200 为例，每 25 Dalton 作为一个扫描间隔 SWATH，每个SWATH 扫描时间设定为 100ms，那么该扫描范围累计需要 32 个 SWATH（1200-400/25=32），完成一次扫描仅需要 3.2 秒。目前SWATH可以根据样品TIC分布进行窗口优化，从而获取更多的谱图信息，提高了精准度和分辨率。通过高分辨高灵敏质谱TripleTOF 5600/+以及最新的TripleTOF 6600进行分析扫描。与传统的 shot-gun 技术相比，SWATH采集模式能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂，从而获得完整的肽段信息。因此，SWATH技术是一种真正全景式的、高通量的质谱技术

分析流程：
样品经胰酶酶切后，采用常规DDA质谱检测技术分析建立图谱库，之后采用SWATH方法进行质谱数据采集。定量数据采用ProteinPilot，Peakview等软件处理。
实验步骤：

具体方法如下：

蛋白提取及酶解

细胞或液氮研磨的组织用8M尿素，100mM Tris-HCL，pH 8.0，1% 蛋白质酶抑制剂的裂解液进行超声裂解，离心取上清进行定量。将提取好的蛋白通过FASP（Filter aided proteome preparation）酶解方法进行胰酶酶切过夜。

质谱分析

取分别上三次酶解后肽段采用数据依赖型串联质谱法(DDA. Data Dependent Acquisition)模式进行质谱采集，肽段混合物用质谱0.1%甲酸溶液溶解后在nanoLC Eksigent 425连接的TripleTOF6600 高分辨质谱上进行分析。肽段在自制的C18纳升柱(150μm i.d×12cm)上进行分析。流动相A和B分别是含0.1%的甲酸水溶液和乙腈溶液。梯度是B相从8%-25% 45分钟，25-35% 15分钟，35-45% 5分钟，最后升至90% 3分钟，流动相流速500nL/min。质谱参数：MS扫描范围(m/z) 350-1500，累积时间0.25s，MS/MS扫描范围(m/z)100-1500，扫描模式：HS高灵敏度模式，累积时间0.05s，一个MS1图谱选择40个最强的母离子进行串级扫描。动态排除时间20s。

建库将质谱产生的.wiff和.scan文件导入ProteinPilotv5.0（AB SCIEX）搜索鉴定，从而获取group文件作为定量分析数据库。
SWATH分析分别取三次500ng肽段通过SWATH模式进行数据采集。液相条件同上，质谱参数：MS扫描范围(m/z)350-1500，累积时间0.1s，SWATH扫描45窗口，扫描范围(m/z)100-1500，扫描模式：HS高灵敏度模式，累积时间0.096s，SWATH采集模式。
将group和swath文件通过Peakview v2.1和MarkerView（AB SCIEX）软件处理分析，定量肽段FDR小于1%。

生物信息学分析

蛋白质/肽段鉴定及定量结果
差异蛋白质统计分析
蛋白质GO分析及差异蛋白GO富集分析
蛋白质Pathway通路分析及差异蛋白的Pathway通路分析
多样品间表达模式聚类分析（适用于样本数≥3的项目）

参考文献：

Collins B C, Gillet L C, Rosenberger G, et al. Quantifying protein interaction dynamics by SWATH mass spectrometry: application to the 14-3-3 system[J]. Nature methods, 2013, 10(12): 1246-1253.
Röst H L, Rosenberger G, Navarro P, et al. OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data[J]. Nature biotechnology, 2014, 32(3): 219-223.
Selevsek N, Chang C Y, Gillet L C, et al. Reproducible and Consistent Quantification of the Saccharomyces cerevisiae Proteome by SWATH-mass spectrometry[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2015, 14(3): 739-749.
Schubert O T, Gillet L C, Collins B C, et al. Building high-quality assay libraries for targeted analysis of SWATH MS data[J]. Nature protocols, 2015, 10(3): 426-441.

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