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目的测试DNATyper?Y24试剂盒的技术性能指标，评估其在法医学中的应用价值。方法对DNATyper?Y24试剂盒的方法学(扩增体系、引物量、热启动酶量、Mg2+浓度、退火温度和循环次数)及技术指标(准确性、一致性、均衡性、稳定性、种属特异性、灵敏度，以及对混合样本、常见检材及建库样本的检测能力)进行测试。结果该试剂盒的推荐扩增条件为10μL体系，lx引物量，59℃退火温度，28次循环。试剂盒准确性、一致性、种属特异性均良好，最小检出量为0.125ng，且不同批次试剂质量稳定，对骨骼、血痕、唾液斑等不同常见检材有较好的适应性。结论DNATyper?Y24试剂盒可应用于法庭科学实际检案与建库。
【英文摘要】ObjectiveThetechnicalperformanceofhomemadeDNATyper?Y24kitwastestedanditsforensicapplicabilitywasevaluated.MethodsDNATyper?Y24kitwasverifiedintermsofgenotypingrequirements(e.g.,amplificationsetup,primerdosage,consumptionofheat-activatedenzyme,Mg2+concentration,annealingtemperature,cyclenumbers)andtechnicalindicators(precision,accuracy,peakheightbalance,stability,speciesspecificity,sensitivity,adaptabilityforvarioussamplesandmixture).ResultsTheappropriateamplificationconditionsfortheDNATyper?Y24kitare10μLamplificationvolume,1×primer,annealingtemperatureof59℃and28cycles,thusleadingthekittotheaccurateandstablegenotypingofgoodrepeatabilityandhighlyspecificforhumanDNA.Thelowestquantityis0.125ngDNAforthekittoobtaincompleteSTRgenotyping.Thekitisadaptableforvarioussamplesandconsistentwithdifferentbatchesofitsproducts.ConclusionsDNATyper?Y24kitissuitableforapplicationintocriminalcasesandDNAdatabasinginforensicpractice.
【全文】【法宝引证码】CLI.A.1245609Y-STR检验作为常染色体检验的一种补充手段，对家系排查、父权亲权鉴定、男女混合成分中男性成分的检测及多个男性混合成分的判定具有重要的应用价值。针对犯罪嫌疑人中男性数量占多数并且同一家系所有男性个体Y染色体连锁遗传这两大特点，目前河南、山东等地正在以县(市)为单位建库，以行政村为单元绘制家系图谱，在家系图谱的基础上采集生物样本，开展Y-STR数据库建设工作{1-4}。由于Y-STR基因座在种族、地域的差异性远远高于常染色体STR基因座，不同地区特别是存在地域隔离的区域，相同Y-STR基因座的等位基因分布可能存在显著差异{5}。国内自主研发的Y-STR检测试剂盒是适应我国群体特征的国产试剂，可为我国法庭科学实验室Y-STR检验及Y家系排查提供有效的技术方案，为国家DNA数据提供安全保障，具有重要的社会效益。DNATyper?Y24检测试剂盒(公安部物证鉴定中心研发)是对之前开发的DNATyper?Y21试剂盒{6-7}的升级和优化，包括25个基因座，其中一个性别鉴定基因(Amelogenin,Amel)和24个低突变率的Y-STR基因座，更适用于数据库建设和案件侦破中的家系排查。本文针对试剂盒进行了方法学验证，并测试了试剂盒的九大技术性能指标，以评价其在法医学上的应用价值。1材料与方法1.1样本男性血液采集卡(长春博坤经典型血样采集卡)样本184份，来自秦城DNA建库平台的日常建库样本；男性样本唾液采集卡70份，来自长春市公安局，系违法犯罪人员数据库样本。同一男性尸源的血斑、心、肝、脾、肺、肾等组织提取的DNA；实验室日常检案积累的各类案件检材DNA样本80份，来自骨骼样本、矿泉水瓶擦拭物、滤纸血痕、血痕布片、棉签、唾液斑、口腔拭子。大猩猩、狐猴、猪、雪貂、兔、牛、犬、酵母和大肠杆菌的DNA样本，其中部分样本由中国医学科学院动物研究所提供，部分样本为实验室收集。1.2检验方法本文实验操作按DNATyper?Y24检测试剂盒说明进行，使用eppendorfPCR仪扩增、美国AB公司的3500xL测序仪进行毛细管电泳检测，之后用Gen-eMapperID-X分析数据，PeakDetection分析的阈值设为50。1.3DNATyper?Y24试剂盒的扩増方法验证1.3.1不同扩增体系测试分别采用5、10、25μL扩增体系对1ng2800M标准品扩增，进行检验并重复1次。1.3.2不同引物量测试分别以1ng2800M标准品为模板，扩增系统中采用0.5×、1×、2×的引物量进行检验，平行测试两次。1.3.3退火温度的测试我不休息我还能学设置扩增程序中的退火温度分别为55、57、59、61、63℃，检验1ng2800M标准品并重复1次。1.3.4不同循环次数测试分别设置扩增程序中的循环次数为24、26、28、30,32次，检验1ng2800M标准品并重复1次。1.4性能指标测试1.4.1准确性及一致性分别使用DNATyper?Y24(五色荧光标记)及AmpFlSTR?Yfiler?plus试剂盒(美国AB公司，六色荧光标记)对同一组样本(92份男性血液采集卡)进行检验，以验证试剂盒分型的准确性。并使用DNATyper?Y24试剂盒对同一个体的血斑、心、肝、脾、肺、肾等组织提取的DNA进行检测，以验证试剂盒对不同组织来源样本分型的一致性。1.4.2均衡性用DNATyperTMY24试剂盒对1ng2800标准品分别进行3组扩增，统计DYS527ab和DYS385ab这两个基因座的等位基因间的均衡性、同一荧光标记的不同基因座之间均衡性以及不同荧光标记物之间的均衡性。1.4.3灵敏度测试分别以1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625ng的2800M标准品为模板，用DNATyper?Y24试剂盒进行检验并各重复1次。1.4.4稳定性采用同一批次的DNATyper?Y24试剂盒(批号为1601)在公安部物证鉴定中心及长春市公安局实验室对同一组唾液卡样本(70份)进行检测，验证试剂盒对不同实验环境的适用性；选取生产时间为2015年10月和2016年6月，批号为1504和1602这两个批次试剂，分别检验同一组男性样本(92份)，以验证不同批次试剂盒的稳定性。将试剂盒各个组分分别反复冻融5～20次后进行检验，分别包括引物混合物、PCR扩增缓冲液、分子内标及等位基因分型标准物(ladder)等，验证试剂盒中各组分的稳定性。1.4.5耐受性分别在标准PCR反应体系中加入血红素，使其终浓度分别为5、20、40μmol/L，以测试DNATyper?Y24试剂盒的耐受性。1.4.6种属特异性测试扩增雄性大猩猩、狐猴、猪、雪貂、兔、牛、犬，以及酵母、大肠杆菌的DNA样本，以测试DNATyp-er?Y24试剂盒的种属特异性。1.4.7混合样本测试将1ng2800M标准品分别按1:1000、1:2000、1:3000、1:4000的比例加人高浓度的9947A，作为模板扩增检测，各重复一次。1.4.8常见案件检材检测用DNATyper?Y24试剂盒和AmpFlSTR?Yfiler?试剂盒对80份实验室积累的各类常见案例检材DNA进行检验。2结果与讨论2.1试剂盒中基因座分布和ladder分型图谱DNATyper?Y24试剂盒中25个基因座分布见图1，试剂盒包括了AmpFlSTR?Yfiler?试剂盒中的17个基因座(DYS19、DYS385a/b、DYS389I/II、DYS390、DYS456、DYS458、DYS635、YGATAH4、DYS438、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS448、DYS439)以及7个符合中国人群遗传特征的Y-STR基因座(DYS460、DYS447、DYS527a/b、DYS444、DYS522、DYS617)[8"10]，另外还包括一个性别鉴定基因Amel。试剂盒中的等位基因分型标准物(ladder)见图2，包括了中国人群中常见的等位基因，分型准确、图谱清晰。(图略)图1DNATyper?Y24直扩试剂盒中基因座分布Fig.lThelocidistributionofDNATyper?Y24kit(图略)图2DNATyperY24直扩试剂盒中ladder图谱Fig.2TheladderprofilefromallelesofDNATyper?Y24kit2.2方法验证结果2.2.1扩增体系测试用5、10、25μL等3种不同扩增体积，分型结果一致，并且随着扩增体积增大，峰值呈减弱趋势(图3)。比较显示，5μL体系效果也不错，但是体系太小容易被蒸干，或者出现丢峰现象。10μL体系比较适宜，峰的高度足够而且各个荧光标记颜色之间的平衡性比较好。与10μL体系相比，25μL体系中峰高有所降低，在200～1000之间，并且在90bp之前出现了一个stutter峰，虽然不影响基因的判读，但在分析数据时仍需注意，所以最推荐的扩增体系是10μL体系，性价比也最高。2.2.2引物加入量测试应用0.5x、lx、2x等3种不同引物量对lng2800M标准品进行扩增，其中0.5x引物量的峰值(RFU)在200～20爱法律，有未来······法宝用户，请登录后查看全部内容。还不是用户？点击单篇购买；单位用户可在线填写“申请试用表”申请试用或直接致电400-810-8266成为法宝付费用户。【注释】【参考文献】{1}巴华杰，张璐，赵阳，等.人类Y染色体STR的发展与应用[J].广东公安科技，2007,87(2):20-22.
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