DNA抽提指南 - 实验方法 - 丁香通

按照RNA分离操作方案在完全移去水样层后，匀浆中的DNA存在于中间层和苯酚层中也可以被分离出来。在沉淀和多次洗脱后，DNA溶解在8 mM NaOH中。用TRIZOL试剂从组织和培养细胞中完全回收的DNA可以用来做样品中DNA含量的测定。同时抽提的基因组DNA可以用于对Northern analysis的结果进行标准化，因为DNA变异程度比总RNA或组织重量要小。[由于来源的不同，所得到的DNA沉淀在进一步应用前可能需要额外的纯化步骤（例如苯酚抽提等等）。] 实验所需但试剂未提供的物品： * 酒精 * 0.1 M柠檬酸钠（用10%酒精配制） * 75%酒精 8 mM NaOH 如无例外，以下操作均应在15�30℃下完成。 1.DNA的沉淀 移除中间层上残余的水样层，用酒精从中间层和苯酚层中沉淀DNA。按最初匀浆化时每1 ml TRIZOL加0.3 ml的无水乙醇，反复颠倒来混合样品。然后将样品置于15�30℃下2�3分钟，再在2�8℃下以不超过2,000×g的离心力离心5分钟沉淀DNA。 小心移除水样层对抽提的DNA的质量至关重要。 2. DNA的洗脱 移除离心后苯酚层中的上清液，如有必要，可以将其保留用于抽提蛋白。用0.1 M柠檬酸钠（用10%酒精配制）洗涤DNA沉淀两次。按最初匀浆化时每1 ml TRIZOL加1 ml柠檬酸钠溶液。每次洗涤时洗涤液要和DNA沉淀在15�30℃下作用30分钟（期间周期性混匀）再在2�8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。在两次洗涤完成后，用75%的酒精重悬DNA沉淀（每1 ml TRIZOL加1.5�2 ml75%酒精），在15�30℃下放置10�20分钟（期间周期性混匀）然后再在2�8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。 对于较大的DNA沉淀（ 200 μg）或样品中含有较多的非DNA物质需要用0.1 M柠檬酸钠（用10%酒精配制）溶液再洗涤一次。[ www.bbioo.com] 3.DNA的再溶解 在开口的试管中空气干燥DNA5�10分钟。（不要用离心干燥；它会使得DNA极难溶解。）用8m M的NaOH溶解DNA，大致的比例为0.2�0.3 μgDNA/μl。一般来说，每107个细胞或每50�70 mg组织要加300�600 μl的8m M的NaOH。用弱碱再溶解DNA是高度值得推荐的，因为抽提的DNA在水或是Tris缓冲液中都不能很好再溶解。8m M的NaOH的pH值只有~9，一旦DNA溶于其中后可以很容易用TE缓冲液或HEPES再调整其pH值。在本步骤中，DNA样品（尤其是来自组织的样品）可能含有一些不溶解的胶样物质（细胞膜碎片等）。以 12,000×g的离心力离心10分钟来除去那些不溶的物质。将含有DNA得上清液转移到一新的试管中。溶于8 mM NaOH中的DNA可以在4℃下放置过夜；如果是长期保存，样品中还应该用HEPES将pH值调到7�8（见表）并加入1 Mm的EDTA。H值调整好后，dna可以保存于4℃或�C20℃。 DNA的定量及预期的产量 取一小份溶于8 mM NaOH中的DNA样品，以适当比例和水混合并测量混合液A260值，以双链DNA的A260值计算DNA含量。每一A260单位相当于50μg双链DNA/ml。若以细胞数分析其相应的DNA产量，大致遵循以下比例：每1×106个分别来源于人，大鼠，小鼠的二倍体细胞分别对应于7.1μg， 6.5μg，和5.8μgDNA。 应用： 通过PCR扩增DNA： 在DNA再溶于8mM NaOH后，用0.1 M的HEPES（见表）将其pH调到8.4。加0.1到1.0μg的DNA样品到PCR反应体系中并执行标准的PCR反应。 限制性核酸内切酶酶切反应： 用HEPES（见表）将DNA溶液的pH值调到酶切所要求的范围。作为另一可选方案，也可以用pH值为7�8的1 mM EDTA透析DNA样品。每ug的DNA加3-5单位的酶。酶切条件按照酶制造商的说明进行，反应时间为3�24小时。在标准的测定中，80�90%的DNA是可被消化的。 溶于8 mM NaOH中DNA样品pH值的调整： （每1 ml 的8 mM NaOH使用以下数量的0.1 M 或1 M HEPES，游离酸。） DNA抽提注意事项： 1.苯酚层和中间层可以在2�8℃下放置过夜。 2.溶于75%酒精中的DNA可以在2�8℃下放置数月。 3.溶于8 mM NaOH中的DNA可以在2�8℃下放置过夜，若要长期保存，将其pH值调整到7�8，并调整EDTA的浓度到1 mM。 疑难解答： DNA抽提 •每mg组织或1×106培养细胞预期的DNA产量 1.肝和肾，3�4μg 2.骨骼肌，脑组织，和胎盘，2�3μg 3.培养的人，大鼠，小鼠细胞(1×106)，5�7μg 4.纤维母细胞，5�7μg •产量低 1.样品匀浆化或裂解不完全。 2.终DNA不完全再溶解。 •A260/280比值 1.70 1.在分光光度计测量前用水而不是用TE缓冲液稀释DNA样品。 2.DNA样品中的苯酚没有完全去除。用0.1 M的柠檬酸钠（用10%酒精配制）再洗涤DNA沉淀一次。 •DNA降解 1.从动物身上取下的组织没有立即处理或冰冻。 2.用于抽提的样品，或已经抽提的RNA样品存放于-5�-20℃，而没有存放于-60�-70℃。 3.使用了Polytron或其他高速的匀浆器匀浆样品。 •RNA污染 1.水样层没有完全去除。 2.用0.1 M的柠檬酸钠（用10%酒精配制）洗涤DNA沉淀不完全。 •其他的应用方面 在行PCR扩增前调整pH值到8.4。 对用于限制性核酸内切酶消化的DNA,调整其pH值到所需的范围，每μg的DNA加3�5单位的酶，对某些特殊的酶最佳条件下允许的反应时间在3�24小时内。一般而言，80�90% 的DNA均可以被消化。       您知悉并同意，丁香通平台展示产品并非为平台自身产品，您发起询价或试用申请后，平台将会把您已提供或按要求提供的相关信息同步提供至所咨询的具体产品商家，由商家为您提供具体产品的价格咨询或产品试用注意事项及相关试用产品或完成相应购买，因此您知悉并授权平台将您的信息进行同步共享。您有权拒绝，但您知悉将无法参加询价或试用活动。