核糖克隆实验

—、材料

1.缓冲液、溶液和试剂.

10XATEN缓冲液

0.5mol/LTris-HCl,pH7.9

2.5mol/L氯化钠

0.25mol/LNa4EDTA,pH7.9

甜菜碱（SigmaB-2629)

蓝色葡聚糖（bluedextran)(SigmaD-5751)

DNA缓冲液（TEN)

10mmoI/LTris-HCl,pH7.9

10mmol/L氯化纳

0.1mmol/LEDTA

乙醇,用25%的DNA缓冲液配成75%

10XKLA缓冲液

500mmol/LTris-HCl碱(Sigma;TrizmaBase)

160mmol/L硫酸铵

1%Tween20

25mmol/L氯化铁

未调整前pH为9.2,逐滴加入盐酸调整pH到7.9，单独取出液滴来检测pH,以防pH计探针上的DNA污染缓冲液。

30%聚乙烯乙二醇3350(PEG),1.5mol/L氯化钠

乙酸钠，3mol/L，pH5.6

T5E5

5mmol/LTris-HCl,pH7.9

5mmol/LNa₄EDTA,pH7.9

2.酶和酶缓冲液

DpnI

KlentaqLA(Barnes1994；Clontech8421-1)

蛋白酶K(Roche1373196)

蛋白酶K储存缓冲液

100umol/Lβ-巯基乙醇

20mmol/LTris-HCl，pH7.9

1mmol/LCaCl₂

50%(体积分数）甘油（630g/L)

RNA酶A(Ambion2270或2272)

3.核酸和寡核苷酸

设计好的载体

已经进行5端生物素-TEG修饰，并且3端核糖胞嘧啶或者核糖尿嘧啶修饰过的引物

4.抗生素

卡那霉素（Sigma),终浓度为25ug/ml

四环素(Calbiochem)，终浓度为12ug/ml

Ticarcillin(SmithKlineBeecham)，终浓度为100ug/ml

5.专用设备

电转化仪器

PCR(薄壁）试管；管壁厚度规则的试管；0.5ml或1.7ml

链霉抗生物素蛋白珠子

6.细胞和组织

电击感受态细胞（Doweretal.1988;Invitrogen18290-015)

二、方法

1.应用末端为核糖胞嘧啶或者核糖尿嘧啶的引物和KLA缓冲液（PH7.9)分别在1.3mol/L和1.9mol/L的甜菜碱中扩增目标片段和载体序列。一些载体的质粒复制子在pH9.2条件下标准的长PCR反应中扩增得更好，但是colEl复制子在pH7.9条件下扩增得好。

为了得到最佳的扩增效率，应该使用已经进行5端生物素-TEG修饰过的引物和如下所述的链霉抗生物素蛋白珠子，与其他DNA聚合酶相比，KlemaqLA酶混合物（BameS1994)得率更高，而且它对甜菜碱的抗性更强（Baskaranetal.1996)。

以质粒做模板的PCR效率稍高，并且如果在PCR之前用限制酶将模板线性化，模板转化进大肠杆菌细胞造成的最终背景要低些。

如果用来扩增栽体或目标片段的模板来自dam+大肠杆菌，DpnI选择通常是个好的办法，并且可能会导致后续克隆步骤中出现不必要的背景。DpnI不能酶切PCR产物，因为含有非甲基化的GATC位点(Weineretal.1994)。

2.向每个100ul的PCR反应中，加入1ul(10U)DpnI,37°C温浴2h。

这种处理可以把单纯载体或单纯目标片段的背景降到0~20个菌落。

3.PEG沉淀步骤。这步的目的是要除去引物和盐。把PCR反应移到厚壁（管壁厚度均匀）试管，0.5ml或1.7ml都可以，因为薄壁PCR试管不能用来离心。然后，加入5ullmg/ml蓝色葡聚糖（用它来显示沉淀的位置）和1/2体积30%PEG3350、1.5mol/L氯化钠（最终为10%PEG，0.5mol/L氯化钠）。室温放置30min或4°C过夜。离心15min。看着蓝色沉淀倒去上清液，以免不小心倒掉沉淀。如果沉淀很薄看不见，尽董避免倒掉沉淀，但是同时保留上清液。用75%乙醇淋洗沉淀，离心8min。在空气中干燥沉淀10~20min。用100ul的T5E5缓冲液重悬沉淀，置于冰上至少lOmin,并不时振荡。

4.胰腺RNA酶A步骤。用T5E5缓冲液稀释200ugRNA酶A到200ug/ml。也可以使用DNA缓冲液（E.Oates，个人交流）。向每100ul的PCR产物中加入6ug（30ul)RNA酶，振荡并轻轻离心。然后把含有RNA酶的PCR产物放在55°C温浴30min，冷却。

5.蛋白酶K步骤。应该用蛋白酶K保存缓冲液将酶在-20°C保存（见材料单）。加入5ug蛋白酶K或大约相同质量（6ug)的上述RNA酶，充分混合，稍微离心一下，65°C温浴30min，冷却。
如果使用生物素引物，立即逬行下述的珠子纯化步骤。否則DNA就已经准备好了。

6.克隆步骤。取2~8ul的载体或目标片段样品进行琼脂糖凝胶电泳，并在旁边加一个浓度标准，用来同时确定载体DNA和目标片段的浓度。克隆时它们的物质的量应该相等，浓度是否精确并不重要。

1~10ul载体=30~100ng，0.02pmol

1~10ul目标片段=5~25ng(目标片段和载体物质的量相等）

加入1XATEN缓冲液至40ul

7.各取20ul克隆混合物作不同的对照，比如在加热前、没有加热、凝胶样品等的对照。按比例配制更多所需的克隆混合物。最小用40ul:20ul做凝胶电泳，20ul用来转化细胞。





8.珠子纯化的DNA可不需要退火，因为它似乎在室温下可以进行自组装（数据没有给出），但是这个加热步骤对非生物素引物非常有帮助。
78°C溫浴2min,然后52°C溫浴30min;或者，先78°C溫浴2min，再65°C溫浴lOmin,然后在大于30min的时间内慢慢地把温度降到52°C或者更低，冷却。保存20ul用作退火后凝胶检测样品。
这些凝胶样品可以用来检测和提高重组效率。常规克隆时可以跳过这步不做，但是，就像做任何DNA克隆实验一样，如果出错了，实验者不做凝胶分析就不知道是什么发生了错误.

9.加入1/9或者1/6体积的3mol/L乙酸钠（pH5.6)和2mg蓝色葡聚糖，加入2~3倍体积的乙酵沉淀DNA,在-20°C冷藏至少30min,然后离心10~15min。用75%乙醇：25%DNA缓冲液淋洗可见的沉淀，然后离心8min。在这步75%乙醇淋洗中，在DNA缓冲液中加入了少量的盐，这样25bp的黏性末端就不会在下面的步骤中解链。

10.在冰上用22ul的水重悬干燥的沉淀，加入的水会由于蓝色葡聚糖变成轻微的蓝色。
取出用作电泳样品或者作为转化的备份。

11.用15ul的DNA去电击转化70ul的电击菌感受态，在5s中之内加入1ml的丰富培养基，然后将其涂在恰当的抗生素培养基上：10min后涂在100ug/ml替卡西林板上，或者30°C5~16h后涂在25ug/ml的卡那霉素板上，或者在30°C2h后涂在12ug/ml的四环素平板上。延长电转化后的培养时间对于表达一些抗生素基因的抗性是必需的。