RTPCR实验方法总结(2)

寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA一、试剂准备1．3M醋酸钠（pH5.2）2．0.1MNaOH3．1×上样缓冲液：20mMTris-HCl(pH7.6)；0.5MNaCl；1MEDTA（pH8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH7.6)、NaCl、EDTA（pH8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。4．洗脱缓冲液：10mMTris-HCl(pH7.6)；1mMEDTA(pH8.0)；0.05%SDS5．无水乙醇、70%乙醇6．DEPC二、操作步骤1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPCH2O洗柱。3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。4．将RNA溶解于DEPCH2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。8．OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3MNaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。10.用适量的DEPCH2O溶解RNA。三、注意事项1．整个实验过程必须防止Rnase的污染。2．步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNAPoly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。4．寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。5．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μgPoly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。RNA酶保护试验((RNaseProtectionAssay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：1．检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。2．由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可*性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。3．由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。4．步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。5．RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。6．一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7．检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA的缺点是需要同位素标记探针。一、试剂准备1．GACUPOOL：取100mMATP、CTP、GTP各2.78μl、100mMUTP0.06μl，加DEPCH2O至100μl。2.杂交缓冲液IPES0.134g、0.5MEDTA（pH8.0）20μl、5MNaCl0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPCH2O至10ml。3.RNase消化液：5MNaCl120μl、1MTris-HCl(pH7.4)20μl、0.5MEDTA（pH8.0）20μl、RNaseA(10mg/ml)8μl、RNaseT1(250U/μl)1μl，加DEPCH2O至2ml二、操作步骤1．反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。（1）设计含T7启动子的PCR引物由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：上游引物下游引物ⅡT7启动子序列下游引物Ⅰ（2）PCR先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。（3）探针合成标记与纯化在0.5ml离心管中加入下列试剂：RNasin（40U/μl）0.5μlGACUPOOLGAC（含GTP、CTP、ATP各2.75mM,UTP61μM）2μl[α-32P]UTP(10μCi/μl)2.5μlDTT(二硫苏糖醇，0.1M)1μl5×转录buffer2μl模板（50ng/μl）1μlT7RNA聚合酶(15U)1μl混合后，短暂离心，37OC保温1hr。加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl,37OC15min,然后75OC10min以灭活DNAseⅠ和T7RNA聚合酶。加入：饱和酚50μl氯仿50μl酵母tRNA（2μg/μl）4μlDEPCH2O100μl室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml离心管中，再加入3MNaAc10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4OC离心13500g×2min,弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步骤）。2．杂交（1）RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。（2）取8μlRNA加入1-3μl探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml离心管中。（2）80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。3.消化(1)杂交管于37OC保温15min，加入RNase消化液，37OC保温30min。(2)加入10%SDS10μl、10μg/μl蛋白酶K20μl，混匀，37OC保温10min。(3)加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。(4)转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3MNaAc15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20OC30min，4OC离心,135000g×10min。(5)弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。