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外周血现已被广泛地被用作骨髓移植、癌症患者接受大剂量化疗或放疗后骨髓重建造所需血干细胞（HemotopoieticProgenitorCellsHPC）的来源。外周血源性干细胞现主要被运用自体移植，其应用面也逐步拓展至异基因骨髓移植中。使用外周血替代骨髓作为造血干细胞的来源有着以下优点：1，易采集；2，对供者无需全身麻醉；3，减少了采集后并发症的发生；4，受者造血系统重建快；5，费用低；6，住院时间缩短或可部分或全部在门诊处完成操作。 相对于骨髓，外周血中的造血干细胞一般只出现一次高峰，其数量取决于供者血体积和/或单个核细胞的数量。由于外周血中造血干细胞含量很低，固常规中运用多极分离技术来收集这些细胞。在早期临床研究中，收集的干细胞作为移植物数量是否足够很不清楚。因为要检测这些细胞数量需要使用集落形成实验，但此法明显不适用于临床，因其大致需要12-15天时间出结果，故无法满足临床中当天出报告决定移植是否继续的要求。此问题自发现CD34抗体可鉴别造血干细胞，并成功地被运用流式细胞仪定量检测造血干细胞后被圆满解决了。 CD34+造血干细胞植活最低数量要求是2-5x106/公斤体重。然而正常人外周血中干细胞数量只占所有有核细胞的0.1%。很明显这些数量的干细胞是不足够运用于移植的，除非使用恰当技术增加外周血干细胞的含量供采集。此技术可通过给予供者集落刺激因子（通常是粒或粒-单集落刺激因子），同时可联合骨髓抑制剂（如环磷酰胺）的方法动员造血干细胞进入循环外周血中。联合使用化疗药物与集落刺激因子造成短暂的循环血中髓系细胞抑制，随后使骨髓代偿性地释放髓祖细胞、造血干细胞至外周血，从而达到动员干细胞的目的。联合使用细胞毒药物与集落刺激因子可延长抑制时间，相对于单独使用集落刺激因子可增加动员至外周血中的干细胞。对于正常人供者不可使用化疗药物来抑制外周血，常使用G或GM-CSF、血小板刺激因子来动员。关于如何使用动员药物请参见其他相关文献。 早期外周干细胞计数 在尚未应用流式细胞仪定量检测CD34+细胞时，外周血干细胞计数常运用单位-粒/巨噬细胞集落形成实验间接求得。这项检测技术通过直接计数干细胞形所的集落来反映干细胞的数量，故被认为是检测是否存干细胞的金标准。但也有学者置疑此检测是否与移植成活率有很好的相关性。因为在这项技术中，各研究单位缺乏统一的检测标准；刺激因子不同的处理方法和不同的配伍使用；集落形成后不同的计数方法都造成了统计数据具有很大的变异性。常规体外集落形成实验主要检测髓系祖细胞并要求大约14天取得结果，使得该项检测无法来确定临床何时采集干细胞；所以以前只根据循环血中的最大集落数（CFU而非CFU-GM）来确定采集多少细胞。 使用CD34识别造血干细胞 自从发现、纯化、标记抗CD34单克隆抗体开始，使流式细胞定量检测在外周血或骨髓中的CD34阳性造血干细胞成为了可能。CD34抗原存在于各种祖细胞上，其中包括多能干细胞和间质干细胞。在某些组织的上皮细胞上也有表达。CD34抗原的分子量为105-120KD，具有一个高度糖基化的类粘蛋白的结构。内皮细胞的CD34抗原与L选择素结合，然而造血干细胞上的CD34抗原的配体至今还未发现，有学者认为此抗原在细胞粘附中起作用。通过与不同特异性的Vibriocholera神经氨酸苷酶和Pasturellahemolytica起源的糖蛋白酶作用可区分出此抗原的不同位点。这些位点根据其与不同的抗体结合情况可分为I，II和III类，最近有报道I和II类抗原应属同一家族，因为它们具有相似的抗原结构和功能属性。这些研究都是基于交叉封闭实验的，故不可作为评价抗体结合效率或抗原空间结构之用。II类抗原位点具有由非糖基化氨基酸构成的线性申展结构，四周由在远N未端组成CD34的I抗原的类糖酶结构环绕。尽管I类与II类抗原几乎合二为一，但它们化学和物理性质是不同的． Siena领导的工作组是第一个报道使用流式细胞仪定量检测CD34+造血干细胞的含量，来决定动员干细胞及采集最佳时间，并研究CD33在干细胞上的表达与移植效果的相关性。CD34阳性细胞运用SSC与CD34双参数流式点图来检测。在此项研究中发现所有的CD34阳性细胞均与形成CFU-CM集落相关；并证实CD34+细胞计数是决定干细胞采集时间有效方法。此外，Fritsch及其工作组发现CD34阳性细胞比例与外周血单个核细胞数量和CFU-GM和CFUGEMM检测的集落形成能力有相关性。这些结果被其他学者相继证实，并使流细胞仪成为定量检测CD34+细胞成为监测动员干细胞和计数移植中造血干细胞数量的有效、精确的工具。 尽管以前工作已证实造血干细胞表达CD34抗原，但鉴别多能干细胞的复杂工作才刚刚开始。Siena及其工作组发现CD34+CD33+双阳性细胞数量与早期移植成功有相关性。同时Tertappen注意到骨髓中提取的CD34+CD38-阴性的细胞在IL-3，IL-6和GM-CSF刺激下能够形成最原始的集落；随着CD38抗原的增加，CD34阳性细胞形成这种原始集落的能力下降。在CD34+细胞中，CD34+CD38-表型的细胞占1.0%左右。随后又发现了其他细胞表面抗原在识别多能干细胞中起着重要作用。对于绝大多数临床应用来说，计数CD34阳性细胞已足够为移植提供可靠、持久的参数。然而计数更为原始的多能干细胞能够提供其他重要的信息，所以有必要发展下面将叙述的技术来达成此目标。此外可发现、鉴别更新的一些干细胞抗体来提供更为直接的检测方案，如：ACC-133和F84.1。 在达到一个稳定、长期的移植成功的疗效中，CD34+阳性细胞最少需求量方面还存在争议。Bender发现大约2x106CD34+细胞/公斤体重的剂量能够保证可靠的移植成功率。在许多病例中，这个剂量很容易从动员的病人或正常人中收集到。Bensinger及其工作组发现CD34+阳性细胞与血小板、粒细胞重建时间有很强的相关性，并建议CD34+细胞最佳剂量是5x106/kg。一个对692例自体移植病例研究也得出了相似的结论。 在移植前处理治疗中，病人的耐受性及用药的强度等因素会造成以上情况，Tricot等观察225例接受PBPC移植的病例和经PBPC输入治疗了难治性骨髓瘤患者，发现以上因素使自体移植中CD34+细胞的最佳剂量各不相同。此研究表明，对于移植前接受化疗少于24个月的病人，快速植活剂量应>2.0X106CD34+细胞/kg；对于长期接受全身化疗的病人（大于24人月）最低剂量则为>5.0X106CD34+细胞/kg。此处接受短期化疗的病人更容易、快速地取得CD34+细胞。总而言之，这些研究表达2-5X106CD34+细胞/kg的剂量对于大多数情况下是足够的，但也有研究表明更高剂量的CD34+细胞移植能够帮助病例更容易克服组织相容性问题。以下将要讨论有关CD34+细胞的检测技术，有些推荐剂量之间的差异正是由于检测方案不同所引起的。 CD34检测方案变异系数及其标准化 流式细胞CD34干细胞计数为成为应用广泛的实时检测PBPC是否足够移植的有效方法。对动员后供者循环外周血中CD34+细胞绝对计数能够预测采集物中干细胞的数量，并越来越多地用来决定何时可开始采集干细胞。根据CD34阳性细胞在样本中的含量将决定是否继续给予生长因子刺激、采集是否继续。每次干细胞采集需要志愿者在护士的照顾下进行3-4个小时的干细胞分离过程，采集的细胞在体外需要进行特殊的处理或进行低温保存。从治疗时间及消耗资源的意义上来说，以上动员、采集过程的费用是非常昂贵的，对于有经济困难的患者来说此部分的费用占了移植总费用的重要比例。在早期的研究中，干细胞动员方案还未被应用，运用全部有核细胞计数作为移植物采集指标；有时会为单个病人采集相当于现在20倍数量的细胞用于移植，这不仅会增加标本保存成本，还会带来病人体液过量的临床问题。CD34+细胞计数作为移植物采集量化标准解决以上所及的许多问题，但它也带来许多新的疑问。 米兰方案 第一个广泛应用的干细胞计数方案是由IstitutoNazionaleTumoriinMilan的Siena等人创立的米兰方案（MilanProtocol）。在此方案中，需准备三管50ul的血样或leukapheresis样本（如白细胞计数小于150ul，如受者样本，则样本和抗体均需加倍）；其中一管留出不作染色，一管加入15ul的抗CD34和CD33抗体，第三管则加入15ul的抗CD2/CD19抗体（计数T、B细胞）。细胞在 目前有很多米兰方案的改进版，分别从：运用不同的CD34抗体、不同的溶血技术、加入其他抗体来提高鉴别力、变换荧光标记、使用CD45抗体或其他核酸染料来更方便地鉴别白细胞等方面进行改进。运用这些技术后，报道的移植所需足够的并且能快速完成的CD34+细胞数量有着巨大差异。经过仔细研究发现这些差异是由于在CD34细胞计数过程中运用了不同的标本处理、染色和分析方法造成的。因为在未动员的正常外周血中，CD34阳性细胞通常小于全部有核细胞的1%，在经G-CSF动员后志愿者外周血中会大于5%（有时在用血小板形成因子动员时可大于20%），对它们的精确计数对许多流式实验室是个重要的挑战。特别在计数小于1%时，又要做出检测来决何时进行采集时，精确计数显得格外重要。 Multi-Center方法研究报告 Multi-Center研究所在北美、欧洲、澳大利亚所做的一系列研究使得在精确计数中存在的储多问题逐步浮出水面。其中的一些问题最先在法国马赛招开的欧洲外周血干细胞计数研讨会中提出。在此次会议中，讨论了临床的CD34计数的价值与在各种检测方案中所应用的不同技术。并就外周血干细胞计数标准方案达成了一致。推荐方案中要求标本需预先作白细胞计数，用来染色的标本体积根据对CD34+细胞数量估算来决定，分析时要求收集足够的有统计学意义的标本数量。方案中推荐使用双标记方法染色，其中包括将2ul的PE标记的CD3抗体和10ul的FITC标记的CD34抗体（QBEnd10）加入250ul的全血进行染色，室温下孵育20分钟，每5分钟用移液器吹打混匀一次；随后加入Ortho公司的红细胞裂解液孵育9分钟，每3分钟震动混匀一次；之后细胞在 马赛干细胞会议发展并拓展了一系列干细胞生物技术、干细胞计数和临床应用方面的欧洲协作组。其中最为重要的是，Sovalat等人向22个实验室发送了新鲜的白细胞采集样本和相应检测单抗供染色与分析。由于使用了不同的检测技术得出了变异很大的计数结果，其变异率达15-100%。对染色方案中最具统一性的步骤是运用同型对照来去除非特异性染色。使用FITC标记的CD34抗体，克隆号为 英国流式细胞仪临床应用协会开展了更为广泛的研究，在此项研究中共分别向15个单位分两次派送了总共28份的白细胞采集品，其中CD34+细胞的含量为0.08-19.31%，由此可得出检测结果在实验室内和外的变异率。每个样本实验室都按自己的计数方案进行检测，随后数据统一汇总。CD34阳性细胞的含量检测结果的最大CV为100.1%，绝对计数的CV为136.6%。 随后Multi-Center分析方法的应用系统地衡量了在CD34计数检测中的变化因素，其中包括：样本的运输、准备、染色、收集和分析。虽然其中涉及了很多因素很难分析，但依然发现许多关键问题所在。一项在北美10个研究单位中开展的实验中，Brecher将21份已洗涤的骨髓或PBPC样本重复送至各研究所，并用其自己的方案染色和分析。其中三家单位应用统一的检测方案。CD34含量检测结果的变异数使用每个送检样本所得结果的最大值与最小值来表示：范围为2.9至749，中位值为76。如去除其中两个实验单位报告的最高结果，变异范围缩小至1.2至27之间（中位值为3.1）。在那些将方案标准化的实验室中，其变异范围为：1.2至4.4之间。在重复性方面，最小变异范围为0至16.5，最大到4.1至133（这个单位只分析了10000个细胞）。在CD34绝计数中的变异范围则是“令人惊恐的”。如此巨大的变异是主要由于设门方案的不同引起的，并能通过使用标准化方案减小差异。澳大利亚的一个Multi-Center研究组证实这个结论，他们将PBPC标本派送至20家参与单位用其自己的方案进行检测。CD34+细胞的比例范围为0.64-2.80%，中位数为1.54%。20家参与单位中，其中9家的结果在中位数的10%范围以内。将Listmode文件给予24家参与单位并用其自己的方案分析，发现其差异主要由所用的分析方案不同造成的，有17%的单位检测结果超出中位数10%范围；当所有参与单位统一使用相同的分析方案则只有0-7%的单位超出10%的限制。最具统一性的方案是ISHAGE多参数分析方案，所有参与单位分析结果全部落于中位数的10%以内。 在一项由Lumley组织的研究中，他将冷冻保存的白细胞采集品在冷藏条件派送至8-12家参与单位分析其中CD34阳性细胞的百分比含量。研究的第一步是将12份标本送至8家参与单位，每家单位使用其自己的染色、分析方案（基于米兰方案）进行检测并获得结果。对所有结果汇总统计发现其CV值为50-235%，在统计学上有显著差异，其中一家单位的结果显著地与其他单位检测结果差异的5%水平。第二步研究是将另外12份样本送往12家参与单位，每家单位使用克隆号为HPCA-2，PE标记的CD34抗体，并用FITC标记的CD45识别白细胞，收集50000个细胞，但实际中有27%的单位没有收集如此多的样本进行分析。对全部结果汇总分析后，其CV值为23-127%，虽仍具有统计学差异，但没有哪家单位的结果与其他单位结果的差异在5%水平。此时，去除那些≧2SD平均值的结果，发现这些值都出于同一实验室。经汇总统计发现，使用标准方案得出的结果降低了结果的CV值：由第一阶段的平均CV值137%降至第二阶段的平均CV值69%。但这也可能是因为第二次计数获得的检测结果比第一次高（第二阶段1.92%VS第一阶段1.23%）造成的。此研究表明各个实验室之间CD34计数结果的CV值仍过高以致于无法比较各个实验室所检测值。 其他研究组也对影响计数结果的因素进行了广泛的检查，如通过提供统一试剂或发行标准分析方案来进行。尽管这些研究减少了一些检测差异，但要进一步地提高实验的精确性需对各个检测中心进行全面的培训并发展标准的计数方案。此项工作由NordicMyeloma研究组广泛开展，他们组织了两个协作组来制定计数标准方案并在24个实验室中进行来提高CD34计数的准确性。第一次协作工作主要集中于标准化标本处理方法；其间制定了一样本处理的标准方法：要求样本在4小内分析；使用Ortho溶血剂与标本孵育8至10分钟溶血；5-10x105细胞与克隆号为HPCA的PE标记的CD34抗体室温下孵育15分钟，同型对照同等条件处理；洗涤2-3次后用150ul1%的多聚甲醛固定。用米兰方案识别低SSC信号的CD34阳性细胞，共分析50000个完整细胞，并减去同型对照阳性颗粒的数量。 在第二次协作中，Nordic首先向参与单位分发了含有三个病例Listmode数据的磁盘供分析。发现在参与单位之间的分析结果差异很小（如对于含有0.29%和1.36%的两个样的标准差分别为0.04和0.17）。随后参与单位又收到了先染色后固定的和还未染色的两种样本。随后对24家参与单位的22家结果分析表明结果比较一致（r>0.9），尽管其中有实验室一直报告较高或较低值。在三阶段中，参与单位要求使用第一次协作中制定的标准方案来检测送检样本。结果显示CD34计数的平均值为0.68%，标准差为0.08。使用更为统一的方案来检测下一标本时，其平均值为3.0%+0.26，范围是2.6-3.3%。最终的推荐方案是：溶血步骤可在染色前或染后进行；加与不加鼠IgG来封闭非特异染色不影响结果；如果检测中发现有非特异性染色，则需阻断后再进行检测；无需对样本进行过滤；孵育与分析之间样本最好只洗涤一次。为了绝对计数CD34细胞，需对样本进行10倍稀释后进行白血胞计数。 应用标准化方案来计数CD34细胞在Benelux的研究中进一步被证实。实验室之间在未用标准方案前的检测变异系数34-106%在应用标准方案后下降至18-30%。错误应用方案后，变异系数又增加至50-82%。 这些研究表明，在CD34计数检测中有众多因素影响着计数的准确性。这些因素可通过以下操作步骤来去除这些影响：1，尽量减少对样本处理步骤；2，使用适当标记的抗体；3，选择适当的阴性和阳性标本；4，收集足够的细胞数来降低变异系数；5，采用标准设门和分析方案。但以上任何一条现都没国际上通用的标准，很清楚我们需要为CD34干细胞计数设立一广泛同意的标准来减少其中的变异性。现将一些标准总结如下。 样本准备 现有很多种方法运用于干细胞计数的样本准备及分析中。在早期研究中，细胞经常经Ficoll淋巴细胞提取液来富集单个核细胞，然后反推外周血或采集品的细胞比例。这种计算方法经常会得出不精确的评估数据，但能部分地反映标本中的细胞量。Fritsch报道单个核细胞分离操作会导致外周血中26%的、骨髓中21%的、采集品中5%的CD34+细胞丢失。现在基本弃用单个核细胞富集法，而改用对全血进行溶血来去除红细胞。在这个操作步骤中，在未经处理的标本中直接加入荧光标记的CD34抗体进行染色，通过加入溶血剂溶解红细胞的步骤可在染色前或染色后进行。这样使经血球仪计数的白细胞数与流式细胞仪经CD45设门后计数的白细胞数更容易比较。一个对不同样本处理技术的系统比较发现洗涤步骤会导致部分白细胞群体丢失，从而造成CD34+细胞的过量计数。这种过量计数可通过在溶血后计数白细胞作为分母计算而非在溶血前来纠正。溶血后不洗方法可保存样本中各种白细胞群体，但这样会改变细胞的光散射信号并增加荧光的非特异染色本底。这样就会导致底估CD34+细胞绝对计数。尽管每种标本处理方法都有其不足之处，但本研究推存使用：先裂解红细胞；洗涤样本；进行白细胞计数作为计算分母；最后进行染色步骤。在本研究中，笔者使用不含固定剂的氯化铵溶血剂（Ortho公司）室温下溶血5-10分钟，随后洗涤2次后染色。对于先染色后溶血的样本，要求白细胞数在2000-3000/ul，这样可避免因样本量过大而造成染色和分析时间加长；样本在此法处理后无法再进行白细胞计数。相比而言，溶血/洗涤法可预先获知样本的白细胞数并能够分析原样中白细胞含量小于50/ul的样本。 溶血剂 通过对不同溶血剂（FACSLysingsolutionBectionDickinson;ImmunolyseBeckman-Coulter;OptilyseBImmunotech,ImmunoPrepBeckman-Coulter；OrthoMuneOrtho;ACKBioWhittaket）的比较发现它们的效果各不相同。各染血剂溶血后CD45阴性碎片占总颗粒数百分比为：ACK，Immunolyse:80%；其他溶血剂大约为50%。Optilyse和FACS溶血后淋巴细胞比例最低，当使用ACK和OrthoMune后CD4和CD8阳性细胞比例不稳定，但所有的这些溶血剂都能使CD34阳性细胞明显地与阴性群体相区分。对于溶血及固定型试剂的检测也得出了相似的结论。这些观察结果显示溶血剂并不象我们所认为的对CD34+细胞计数无影响。要避免延长溶血时间，除非标本已置于冰上停止了溶血。 样本问题 有些样本可能存在某些特殊问题。血小板可能会与CD34+或CD34-细胞结合影响精确计数。这个问题可通过增加EDTA来解决。聚集的血小板可能会与CD34、CD45抗体微弱结合，但可通过巧妙的设门方案将其去除。 样本的储存及运送 越来越多的采集品因要合并或体外富集或要被运送至流式检测中心，样本都需被过夜保存。在以上这种情况下，样本中细胞群的活性和被分析细胞潜在的改变等问题逐步显现出来。现在对这些细胞最佳的存储及运输条件现在还未明确地建立。各个实验室对标本保存温度从室温至 CD34抗体的选择 对于CD34抗体及其荧光素的选择现还有争论。最初因缺乏直标的CD34抗体，采用未标记的CD34抗体与FITC标记的荧光二抗来间接检测。这样一来使原本复杂的检测与二抗的非特异结合和如何识别阳性细胞等问题掺杂在一起，更难以处理。随后一系列不同荧光素标记的CD34抗体的出现使以上情况有所改观。这些抗体能与CD34抗原的I、II、III类位点结合，CD34的不同抗原位点可根据其对不同的蛋白水解酶的敏感性来区分。对Vibriocholera神经氨酸苷酶和Pasturellahemolytica起源的糖蛋白酶敏感的称之为I类位点，针对此位点的抗体克隆号有：MY10，B 使用III类位点特异性抗体能最大限度地提高检测的敏感度。这是因为抗体与荧光素结合后，其结构可能会发生改变从而导致一些抗体无法完全检测某些样本中的CD34+细胞。基于以上情况，发现针对I类抗原的抗体此问题最为严重，它在与荧光素结合后，如FITC，即失去活性；此外还发现这些抗体与PE荧光素结合后其特异会严重下降。相对而言，PE标记的II类抗原能够检测样本的所有CD34+细胞，但它一旦与FITC结合后也会丧失一部分结合能力。使用抗II，III类位点的抗体计数采集品与脐带血中CD34+细胞，发现其相关性系数为0.975。现普遍推广使用与III类位点结合的抗体，这些抗体能有效地与多种荧光素结合如：FITC、PE、PerCP、APC和PE-CY5。任何标记的抗体都要仔细观察其是否会有潜在的交叉反应，此外还要注意它们可能会与某些样本中聚集的血小板结合。 对于II类位点的抗体在计数骨髓或外周血中CD34+细胞时，其有效性评价不一。有报道认为QBEND10抗体因其与死细胞的结合而增加非特异性染色且与目标细胞的结合强度也不高，所以它不适合作干细胞计数。但FITC标记的抗体确实存在以上情况，FITC标记的抗体阴性检测结果就能说明这种情况，而PE标记的抗体则正常。 阴性对照 干细胞计数中另一个难点是如何选择一个恰当的阴性对照。一般在流式细胞仪上，选用与抗体标记相同的同型免疫球蛋白作为非特异性染色的本底，但这种方法没有体现针对具体抗原的非特异性染色的情况。在用CD34抗体染色的标本中，目标细胞群可能少于总细胞群的0.1%；而只有目标细胞群大于1%时才合适用同型作为阴性对照，这样就很难区分检测管中的阳性细胞是特异性染色或非特异性的。 另一种可选方案是采用多参数设门技术来区分特异性结合群体。通常CD34阳性细胞同时也表达CD45，并且这些细胞的光散射信号也有其特征。在CD45/SSC双参数图中，CD34阳细胞与淋巴、单核、粒细胞相分离独立成群。平行对比实验发现用多参数设门检测的阳性细胞中不含有荧光标记的同型对照阳性的细胞。实验表明多参数检测或结合逻辑设门将成为一标准，特别是在运用定量技术检测特殊的染色细胞群体时。这个方案要检测样本中的极少数细胞群时显得格外重要。 有学者建立了另一阴性对照方案，他将已与未标记的CD34抗体孵育后的标本再与荧光标记的CD34抗体孵育，此时阳性的细胞则算为非特异性染色。但考虑到未标记的CD34抗体也存在非特异性染色，可能会覆盖标记抗体的非特异性染色。此法还未与同型对照作过比较。 阳性对照 在临床检测中需要检测阳性样本，据此来检查操作过程是否正确，并可作为质控。在CD34检测项目中，要取得易制备、稳定可靠的阳性标本并非易事。现有几种制作方案被实验室接受。阳性标本一般使用各种表达CD34抗原的细胞株来制备。运用最广的是KG1这强阳性表达CD34的细胞株，当它被加入至临床样本中时，不会影响原样本中的各细胞染色属性（Coulter和R&D公司的质控试剂使用的就是这种技术）。由于这些细胞形态较大有其特有的光散射属性，它们作为CD34+细胞加入未动员的全血中并不能很好的模拟真实的样本，从而使检测质控样本的方案不能适用临床样本。虽然有可能从一个长期志愿者身上抽取样本作为质控，但由于无法得知其真正的阳性细胞数，又该法很难常规单位实行所以并不理想。以上问题可通过收集同一个具有高和低CD34+细胞数病人的标本，将其分装后冻存。冻存后的样本在光散射信号与CD34表达上与新鲜样本比较一致。每天可检测一管解冻扣的样本作为阳性质控品。当使用这些样本作质控时，要检测样本中细胞活性并要使用多参数方案来减小差异。 在美国，临床实验室中的操作技能考核也要同时进行，这些考核标准由若干家研究机构的临床流式实验室共同制定，其包括CollegeofAmericanPathologists和PTP。这些测试是在正常样本或白血病样本上进行的，而不使用CD34+的血细胞样本。这是由于各个实验室对CD34+细胞计数报告的给果差异实在太大，又不能找到大批量、稳定的、已了解清楚的样本来进行考核。如能够制备出抗原染色稳定、适用面广、储存方便、使用效期长的质控品，则以上问题可得到解决。如以上任务能达成将能加速发展能减少实验室间与实验室中变异的实验技术。今后或许可使用流式标准微球来达成此目的。 样本获取 另一个值得注意的问题是在干细胞计数中要分析多少个细胞。传统实验中，如分析目标在白细胞群体中，一般采集5000至10000个细胞分析。但当进行CD34干细胞计数时，由于CD34+细胞一般只占1%整单个核细胞，固可将其视作泊松分布曲线，如要得到一个变异系数为10%左右值，就要采集100个阳性细胞；采集的细胞数量要根据CD34细胞的比例来决定。尽管理想状态下，应对每个样本采集尽可能的细胞进行分析，但鉴于标本细胞的数量、流式所有软件的功能、和数据的存储空间等因素的限制而无法做到。普通实验室一般在未设门的光散射图中收集50000至75000个细胞进行分析，来获得一个比较精确的结果。在分析过程可通过设门排除死细胞，但一旦去除这些细胞会使其后所分析的细胞群体数量减少。 数据分析 如上分析所见，要检测阳性细胞需要进行双参数或多参数分析。后者多参数分析有助于排除样本中CD34弱表达群体，其可能包含细胞碎片或其他非干细胞颗粒。许多实验室还加检了CD38、CD33和CD90来进行一步计数更为原始的干细胞，或来寻找与临床移植效果更有相关性的细胞群体。这种分析要求流式操作者具有更多的操作和统计技巧。现有很多分析方案可用于此目的；其中一些是基于原来米兰方案修改而来，它是通过CD34/SSC设门去除细胞碎片、红细胞和聚集物；阳性颗粒需要满足：CD34阳性表达，SSC信号较弱，细胞独立成群。有学者使用7-AAD染色去除死细胞，用CD14去除单核细胞的方法来分析。首先设门选取7-AAD阴性的细胞，并将其显示在CD34/CD14双参数图中并从中去除单核细胞；在此方案中，可将CD34阳性细胞再次显视在CD34/SSC图中分析并与相应的同型对照作比较。随后对于以上方案又有修改，将CD45替代7-AAD设立白细胞门，后进行分析。 ISHAGE方案 Sutherland于1994年在它的研究使用与以方案相似的手段分析，随后此方案被ISHAGE收录作为推荐方案使用，旨在确立一个普遍通用的、可排除实验室中或实验室间差异的方案。这个方法是由门不断累加来完成的。第一个门是基于CD45/SSC双参数图上的；通过对其设门可去除红细胞、碎片、和聚集物，这些干扰在造血细胞样本中尤为多见，特别是在样本使用溶血-免洗法处理后。通过此步骤也为以后计算CD34阳性细胞比例提供了可靠的分母（总白细胞数量）。在R1门中，最少要包括75000个细胞，并在R4门要计数超过100个CD34阳性细胞。将通过R1门获取的细胞显示在CD34/SSC双参数点图，在此图中设立R2门并调节其位置包含所有CD34强阳性或弱阳性的并SSC信号弱及中等的细胞。建立一CD45/SSC双参数点图，将以上CD34阳性细胞显示于其中；在其中设门R3门去除CD34阳性颗粒中的聚集血小板、淋巴细胞和单核细胞。将R3门中圈定的细胞显示在FS/SS图中以检测细胞是否落在平时的幼稚淋巴细胞门R4中，通过R4要去除比淋巴细胞小的颗粒。（注：如何确定R4门的位置呢？方法如下：在CD45/SSC双参数点图中设立R5门圈定CD45强阳性且SSC低信号的淋巴细胞群体，将R5门中的细胞显示在R4门所在的FS/SS双参数直方图中，根据其中的淋巴细胞的位置调节R4门，确定R4门在FS和SS轴上最小值的最低范围。）在脐血标本中，会出现CD45/CD34双阳性的血小板集聚颗粒，但它们的侧向散射光弱于真正的CD34阳性细胞，可被处于幼稚淋巴细胞位置的R4门排除。最终在R4门中读取CD34阳性干细胞计数的数值。此时如检测CD45/ISOTYPE双染的阴性对照，在ISHAGE方案设门分析，在R4门中几乎不见非特异性染色的颗粒存在。如在某些情况下R4出现非特异性染色颗粒，则在样本计数时要从R4门减去非特异性染色的细胞数。 对于此方案有一争论，是否所有CD34特异性染色的颗粒CD45都是弱表达。这了解决此疑问，在仪器调节和设门方面又作了改进，两个独立的直方图被加入上述的四图型方案中。在第个直方图中增设R5门来精确圈定淋巴细胞：CD45强阳性且SSC低信号。并将这些细胞显示在第6个FS/SS双参数直方图中。据此可确定R4门的圈定幼稚淋巴细胞最小范围（第4个直方图为第6张的拷贝）。这样就能最大限度地去除血小板、未裂解的红细胞、和其他碎片。这张直方图还可以确定FS的预值设置是否适当，FS和SS的电压设置是否足够。因为在此图中要确保CD45阳性的最小淋巴细胞能够适当地在FS/SS图中显示出来。建议最小淋巴细胞的FS参数强度在1024线性坐标上，位于200左右的位置上。当FS/SS的电压及域值都设置完毕后，调整第1直方图中R1门的位置，使其包括所CD45弱阳性和阳性颗粒。R1门在CD45从标的下限则根据以下直方图来确认：建立第5张CD45/CD34双参数直方图，根据CD34阳性颗粒的CD45表达的最小值建立十字门，确保所有CD34阳性CD45极弱表达的细胞全部在CD45设定界线的左侧；然后根据此进的CD45界线位置确定R1门的最小值。 CD34+细胞百分比检测可通过对白细胞决对计数转换成CD34+细胞决对计数。在原有的ISHAGE方案基础上，在第三或第四荧光通道中检测已知数量的标准微球便能达成以上目的。这样就能使无法定量的单平台流式细胞仪变为能直接绝对计数干细胞的精确仪器。ISHAGE方案完全兼容使用7-AAD荧光染料进行样体活性检测，这样就能在样本中绝对定量计数有活性的CD34+阳性细胞。这一点对临床上在检测抽取或合并时间过长的样本时十分有意义。 DNA/RNA染料/CD34PE/CD45PC5+定量荧光微球（PerfectCountRkitforCD34+CellEnumeration,MultiSciencesCo.Ltd）检测试剂盒分析说明 DNA/RNA染料在FL1中检测，用来识别所有有核细胞，在流式细胞仪分析时作为圈定白细胞的基础。 采用标准ISHAGE方法进行CD34PE/CD45PC5染色分析，绝对定量微球BD机器在FL4通道内检测，Coulter机器可在FL3通道内检测。 
