杂交瘤细胞和重组抗体

概述在过去的二十五年里,利用杂交瘤细胞生产了成千上万的鼠单克隆抗体.人们用同样的技术从转基因鼠中克隆人类的抗体,并设计了全长型抗体和重组片段,它们可以被用于多种诊断和治疗.而且如果他们能在哺乳动物细胞,牛奶及植物中表达,就可以大量获得. 一个世纪以前,Paul Ehrlich提出了著名的侧链理论来解释抗原抗体的相互作用.他不久又铸造了一个虚构的短语"魔弹"来形容抗体对准及中和抗原.七十五年以后 Georges K hler and César Milstein发明了单克隆抗体技术,因此为细胞生物学和临床诊断学的巨大进步铺平了道路. 鼠和人的单克隆抗体 抗体分泌杂交瘤是由生长是不确定的骨髓瘤细胞得到的.一些不能分泌的骨髓瘤细胞系缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转化酶(HGPRT), 被确定作为融合配偶 .为了选择成功的融合细胞,细胞须在一个含有次黄嘌呤,氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的介质中培养,这样只有融合细胞可以增生.噬菌体的发展加强了抗体库的筛选,从而为获得人类单克隆抗体提供了新的手段..人类抗体基因的转移 用同源重组技术删除重链结合区(JH)及Ck区可以遏制鼠胚胎干细胞上的IgH和IgK的基因位点,这样的小鼠不产生抗体. 要达到最有效的人类抗体基因转移,需要克隆酵母菌人工染色体(YACs),因为它可以和大片段的染色体DNA吻合. 通过融合缺乏鼠HGPRT的ES细胞和包含YAC的酵母菌原生质球,最终将YAC插入片段整合到鼠的胚系上.被选择的ES细胞微量注入胚细胞后,产生成功整合人抗体序列的小鼠,该序列可以在DNA胚系里编码大部分IgH和IgK基因位点. 转基因小鼠体内的人抗体 免疫后的转基因小鼠可以产生功能上很重要的高亲和力的人抗体.通过普通的杂交瘤技术可以实现克隆和生产. 鼠体内的人抗体和人细胞产生的人抗体可以通过他们糖基化的状态加以区别 .预期的结果在最初的实验中达到了,该实验利用含人抗体的小鼠和由鼠分离的杂交瘤细胞和啮齿类动物细胞系得到人抗体.抗体片段的重组 由重链可变区和轻链可变区组成的Fv片段,是包含抗原结合位点的最小免疫球蛋白片段.然而,Fvs的两条链的结合力比Fab段的要低,Fab段也是由CH1和CL的不变区组成的.VH和VL之间是由肽段连接的,二硫键和"节和孔突变"可以加固他们的连接. 单链Fv片段 scFv在非靶组织中滞留时间较短,在血液中清除速度较快且更易侵入肿块.它有较低的免疫原性,并较易和蛋白质及肽结合.单一抗体片段 它和轻链可变区相互作用的粘连的碎片影响了他们的溶解度和稳定性.它和抗原的亲和力较低而且和不相干的抗原有交叉反应的趋势.构建多价体Fv抗体为了增加单价体scFv的亲和性,可以强制缩合肽段使它们形成多聚体. 产生式系统 细菌,酵母菌,植物,昆虫细胞和哺乳动物细胞的抗体和抗体片段的产物都有它的表达系统. 细菌:不能装配所有糖基化的抗体,但是可以装配抗体片段的产物.酵母菌:可以表达完整的抗体,但含有高的甘露糖和多分支的寡糖,而且在效应器功能方面有缺陷.携带杆状病毒群的昆虫细胞植物:它们的抗体都含有碳水化合物,但结构上和哺乳动物细胞产生的不同.骨髓瘤细胞和哺乳动物非淋巴样细胞:都可以表达全功能抗体.哺乳动物细胞表达 哺乳动物细胞系表达的重组子抗体,暂时或稳定的决定于所需要的蛋白质量. 为了获得稳定的转染体细胞系,可以广泛的应用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或鼠骨髓瘤细胞系.利用占优势的或隐性的扩增标记进行载体扩增后,可以增加这些细胞的生产力. 骨髓瘤细胞可以被表达载体转染,该载体包含免疫球蛋白基因和谷氨酰胺合成酶基因,骨髓瘤细胞可以在游离谷氨酸的介质中培养. 含抗体的奶为了使哺乳动物的乳腺产生乳蛋白以外的其它蛋白质,可以从超排卵供体的输卵管微量注射数百个复制体到受精卵而引入胚系序列,使外来基因和DNA融合,这些基因编码乳房特殊调节序列.经过一段时间的离体培养,可以把胚胎转移到假孕动物的输卵管或子宫,并发育到产期.最初的奶纯化阶段使用普通的操作,也就是移去酪蛋白和脂肪.澄清的乳清包含高浓度的相关抗体,它可以通过离子交换和亲和层析来纯化.纯化的抗体和从哺乳动物细胞培养中得到的抗体没有区别.重组子抗体的细菌产物离体培养重组后的大肠杆菌的细胞质包涵体可以产生抗体片段.分子内二硫键形成功能性抗体片段可以分泌到壁膜间隙甚至大肠杆菌的介质,这需要熔合细菌信号肽到抗体N末端.然而,高水平表达常常导致不溶解的抗体片段转运到周质后积累. 大肠杆菌一些折叠部分的过度表达,不能增加可溶性抗体片段的产量.对照的,共转染细菌周质转运蛋白后会增加产量. 结论从杂交瘤细胞得到的鼠单克隆抗体提供了生物学临床研究和诊断的重要工具.仅人类基因组工程预期能定义大约100,000个编码同等数量蛋白质的功能基因.最激动人心的发展之一是人单克隆抗体的治疗上的应用,它比鼠抗体更有效和安全.Ehrlich的最早的关于"魔弹"的预言将会被实现.