【求助】骨髓细胞作FISH前如何处理？

作FISH前先要制备染色体：骨髓细胞染色体制备方法包括直接法、短期培养法和同步法等3种。直接法是指骨髓自体内取出后不经培养立即予以各种处理后制片，短期培养法是指骨髓经有核细胞计数后按一定的细胞密度（1～3×106/ml）接种到培养基内，经过24或48h培养后再收获细胞制片。同步法是指应用MTX或氟脱氧尿嘧啶核苷（fluorodeoxyuridine，Fdu）处理细胞17h，使其同步化，再用秋水仙酰胺作用短时间，就可得到大量的晚前期、前中期、早中期和中中期的有丝分裂相，使单套染色体的带纹数达到400条、800条甚至1000条以上，从而大大提高了分辨力。MTX法需换洗细胞以去除MTX，才能解除其对细胞的阻滞作用，故手续较繁；而Fdu法由于省去了中间换洗的步骤，手续较为简便。此外，还有在细胞收获前2h加入溴乙锭10µg/ml以阻止染色体收缩从而获得高分辨染色体的方法。 以往学者们大多推荐直接法，当时他们认为，直接法反映体内细胞的真实核型状况；而培养法则有使正常细胞超过异常细胞的选择性生长倾向，故易于导致假阴性结果。目前认为应用骨髓细胞培养法能揭示更多具有染色体异常的细胞[23]。这是因为白血病细胞和正常细胞在体内外的细胞动力学不同的缘故：白血病细胞在体内的增殖率低于正常细胞，故直接法时正常核型的细胞检出机会较多；短期培养后白血病细胞的增殖率增高，正常细胞的增殖率反而降低，故异常核型检出机会较多[24]。此外，采用直接法制备的标本不但分裂相数量较少，而且染色体的质量也较低劣，常显得短小，分叉甚至发毛，故不利于各种显带处理。培养法不但可提高分裂相的数量，而且也使染色体质量得到某种程度的改善。不过直接法也并非一无可取之处，见于直接法的异常克隆经短期培养后反而消失的例子间或也可遇到。实际工作中究竟采用哪一种方法为好？我们认为，急性非淋巴细胞白血病（acute nonlymphocytic leukemia，ANLL）以培养法为首选； ALL因其白血病细胞体外培养时分裂指数较低，故以直接法为优，CML和骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）因均为涉及多能干细胞的克隆性疾病，异常核型可见于来自粒系、红系和巨核系中任何一系的细胞，故可在直接法和培养法二者之中任择其一。然而为了确保染色体检查的成功并提高异常核型检出的机会，明智的做法最好同时采用直接法和培养法来制备骨髓细胞染色体。同步法由于手续较繁，技术要求更高，一般不作为常规方法应用。除了同步法之外，近年来还报道了高中期相法（hypermetaphase）可提高白血病标本的有丝分裂指数（MI）。高中期相法通过延长有丝分裂阻滞剂对细胞的 作用时间（12～24h），使尽可能多的细胞停留在分裂中期，从而得到大量分裂相。这一方法最初用于中期荧光原位杂交（M-FISH），旨在通过增加分裂相，使M－FISH检测白血病的微小残留病（MRD）成为可能[25]。我们曾用此法结合骨髓直接法和短期培养法对22例恶性血液病患者作了比较研究，结果发现，直接法的平均MI为0.71‰,短期培养法的平均MI为1.00‰，而高中期相法的平均MI为9.31‰,统计学分析表明后者与前二者的差别有显著意义(P<0.05)。分裂相最多的标本一个低倍镜视野甚至可见30多个分裂相，虽然大多数分裂相的染色体较短，但仍有部分分裂相染色体长度适中，分散良好，适合显带处理和核型分析。国外有的实验室已将此法作为染色体制备的常规方法之一。 不论直接法，培养法，还是同步法，其染色体制备过程均包括以下步骤：（一）应用秋水仙素，阻留中期分裂相。秋水仙素系一种生物碱，其作用有二：①破坏纺锤体，使细胞分裂停止在中期；②使染色单体收缩，形态典型，宜于观察和分析。秋水仙酰胺为其衍生物，功效相同而毒性只及其1/30～1/40。秋水仙素的效果与其浓度和作用时间密切相关。浓度愈高，处理时间愈长，则MI愈高，而染色体愈短；反之，则MI愈低，而染色体愈长。因此分裂相数量和染色体长度是一对矛盾，应兼顾这二者而确定秋水仙素的浓度和处理时间。终浓度为0.05µg/ml的秋水仙酰胺处理1h是国内外一致推荐的浓度和时间。（二）应用低渗溶液处理细胞，使制片时染色体获得满意的分散。低渗溶液中以0.075M KCl为最理想，使用前应预温至37℃。不同组织所需处理时间并不一致。外周血标本处理15min为宜，骨髓标本需处理30min。处理时间太短，则染色体铺展不好；处理时间过长，可导致细胞破碎和染色体肿胀以致染色体人为丢失和带纹不清。（三）应用固定剂处理细胞，防止其变质，其次由于抽提了与染色体结合的组蛋白，显带后能产生清晰的带型。常用3:1甲醇、冰醋酸溶液，反复多次固定，直至细胞悬液澄清为止。固定剂需新鲜配制，以免产生沉淀，影响其固定效果。（四）气干法滴片使细胞膜破裂，染色体分散。通常的做法是将洁净玻片浸泡在冰水中，滴片时取出直立于滤纸上，吸去多余的水，只留一薄层在玻片表面，用吸管吸取细胞悬液从10cm高处滴下，每片2滴，立即吹气，再通过小火焰，使其干燥。另一种做法是将玻片浸泡于95%乙醇中，滴片时取出重新浸泡于20%乙醇中，滴片后不吹气，立即在火焰上方通过，再将玻片边缘通过火焰中心部以促使附着于玻片表面上的固定液着火燃烧，此即所谓边缘燃烧法。做好的片子可直接作FISH，否则可在第(三) 步把标本放入－２０度冰箱保存。用时再滴片。

非常感谢！！！但感谢实在说的太迟了，不好意思。