
TheEnd-RepairMixconvertsDNAcontainingdamagedorincompatIBLe5′-and/or3′-protrudingendsto5′-phosphorylated,blunt-endedDNA.Thislow-concentrationformulationoftheEnd-RepairMixiscompatiblewithapplicationsrequiring 1microgramofDNAtobepreparedforblunt-endligation.Theconversiontoblunt-endedDNAisaccomplishedbyexploitingthe5′→3′polymeraseand3′→5′exonucleaseactivitiesofT4DNAPolymerase(P7080).T4PolynucleotideKinase(Y9040)ensuresthattheendsoftheblunt-endedDNAfragmentsare5′-phosphorylatedforsubsequentligationbyT4DNALigase(L6030-HC).
SourceofProtein
Purifiedfromstrainsof E.coli thatexpresstherecombinantT4DNAPolymerase,andT4PolynucleotideKinasegenes,respectively.
Suppliedin
100mMKCl
10mMTris-HCl
0.1mMEDTA
1mMDTT
0.1%TritonX-100
50%glycerol
pH7.4@25°C
SuppliedWith
B9140(10XEnd-RepairBuffer)
N2060(1mMdNTPs)
10XEnd-RepairBuffer(B9140):
1MTris-HCl
500mMNaCl
100mMMgCl2
50mMDTT
0.25%Triton-X100
pH7.5@25°C
Purifiedfreeofcontaminatingendonucleases.Inaddition, 99%enzymepurityisanalyzedbySDS-PAGE,andnegligible E.coli genomicDNAisconfirmedbyqPCR.
FunctionalAssay
2µLofEnd-RepairMixwasaddedtoadoublerestrictionenzymedigested,dephosphorylatedplasmidDNAin1Xreactionbuffercontaining0.1mMdNTPsandincubatedat25°Cfor30minutes.Competentcellsweretransformedwiththeligationmixure,platedontoLB/Amp/X-Galplatesandincubatedovernightat37°C.ControlreactionsconsistingofEnd-RepairMixwithoutT4DNApolymeraseand/orT4PolynucleotideKinaseweretestedinparallel.TheefficiencyofthereactionwasevaluatedbycomparingthenumberofblueandwhitecoloniespresentintheEnd-RepairMixplatestothoseofthecontrolplates.
ATPisnotrequiredbecausetheT4PolynucleotideKinasecanutilizethedeoxynucleotides(dATPanddTTP)usedinthereactionasphosphatedonors.
LimitationsofUse
Thisproductwasdeveloped,manufactured,andsoldforinvitrouseonly.TheproductisnotsuitableforadmiNISTrationtohumansoranimals.SDSsheetsrelevanttothisproductareavailableuponrequest.
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