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【交流】抗体制备及相关技术支持,有问题尽管问~~~ 本人从事单抗、多抗的制备，鉴定（Western Blot、抗体亚类测定等），纯化，抗体标记等，以及相关试剂盒的研发。另外胶体金、竞争ELISA等也有一定经验。非常乐于为大家解答问题！单克隆抗体的制备这方面 对于一个新手请给一点建议 谢谢请问一下抗体亚类测定的方法及原理？以及辣根酶标记选用的中间连接物哪个好？请问: 可不可以直接跑SDS-PAGE,然后将目标带切下来磨碎之后置备抗体啊? 每次打兔子需要用多大的量? 胶的质量和蛋白的质量有没有什么要求(我的目标蛋白的表达量很大)谢谢!抗体亚类测定的方法及原理现在有 HBT的斑点法检测试剂盒&cell2cell的酶免试剂盒不外乎包被抗鼠IgG，标记抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgA、IgM等或者包被抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgA、IgM等，标记抗鼠IgG这两种方法！HBT较贵，cell2cell便宜直接跑SDS-PAGE,然后将目标带切下来磨碎之后置备抗体是可以的，但是此时的蛋白处于变性状态制备的抗体都是针对蛋白的一级结构，用此抗体做WB是没有问题的lzsgxl ，您好！我用SDS-PAGE胶直接研碎后，和佐剂＋PBS混合直接注射给小鼠腹腔可以么？这样注射需要注意什么问题？针的孔径有一定要求吧？还有，给的抗原量和液态抗原相比，有什么不一样么？谢谢！！mameng wrote:单克隆抗体的制备这方面 对于一个新手请给一点建议 谢谢1 首先要考虑做什么物质的抗体，若为蛋白等，需要考虑到其种属交叉性。根据抗体的用途，考虑免疫方案，筛选方案等。2 单克隆抗体制备，单从技术而言，是一个常规的技术了，目前有比较成熟的书籍，我比较推荐金伯泉的细胞与免疫学试验技术，可以从网上搜索下载。按照这个指导，做抗体是可行的。3 了解实验室的具体情况。抗体制备是一个比较长时间（几个月）的试验，所以在试验中需要考虑到各个方面，涉及到动物免疫，融合，克隆，亚类测定，ELISA等等试验，其中无菌操作，防止污染，包括支原体，真菌污染，细胞系之间的污染；培养基配置，ph，血清质量等比较重要。需要做充分的准备，若实验室有人做过单克隆就比较顺利一些了。yager2500 wrote:请问一下抗体亚类测定的方法及原理？以及辣根酶标记选用的中间连接物哪个好？目前亚类测定的方法主要有：斑点免疫，ELISA,免疫双扩散。不同的产品原理可能有些出入，但大致如下： 斑点免疫：各抗亚类抗体分开点膜＋要测定抗体＋属二抗，显色。方法灵敏，需要控制本底。 ELISA: 针对属的抗体＋要测定抗体＋各抗亚类抗体，显色。方法灵敏，需要控制本底。 免疫双扩散：各抗亚类抗体和要测定的抗体分别加入琼脂孔中，扩散，18－24小时后，观测沉淀条带。方法较以上两个灵敏度要低，有时不出现条带，抗体浓度需要浓缩。目前roche出品的抗体亚类鉴定试剂盒，是彩色胶体颗粒，反应形式是免疫层析试纸形式的，几分钟就可以出现试验结果。我这边用的是国外进口的亚类分型试剂盒，是双抗体夹心ELISA法，一般半天时间就能出结果。yager2500 wrote:以及辣根酶标记选用的中间连接物哪个好？能具体说一下吗？我想用HRP标记已制备好的单抗，有两个问题想请教下：1.HRP选个公司的，sigma公司网站上有很多种，该选哪那种2.单抗纯化用G蛋白的柱子纯化影响大吗？谢谢了先～～～sigma公司的产品目录：Unmodified Horseradish Peroxidase (HRP) Product NameProduct # Sigma Type ILyophilized powder, Essentially salt freeSpecific Activity: 15–150 units per mg solidRZ: Approx 1.0P8125Sigma Type IILyophilized powder, Essentially salt freeSpecific Activity: 150–250 units per mg solidRZ: Approx 2.0P8250Sigma Type VILyophilized powder, Essentially salt freeSpecific Activity: 250–330 units per mg solidRZ: Approx 3.0P8375Sigma Type VI–ALyophilized powder, Essentially salt freeSpecific Activity: 250–330 units per mg solidRZ: Approx 3.0This product is also assayed using ABTS for easy comparison to other suppliers unit: approx. 1,000 units per mg solid.P6782Sigma Type VIIILyophilized powder, Essentially salt freeSpecific Activity: Minimum 70 units per mg solidP1014Sigma Type XIILyophilized powder, Essentially salt freeSpecific Activity: 250–330 units per mg solidRZ: 3.0Chromatographically purifiedPreliminary isoelectricfocusing data indicates this is primarily isoenzyme CP8415Sigma Type XCrystalline suspension in 3.2 M (NH4)2SO4 solution containing potassium phosphate buffer, pH 6.0Specific Activity: Approx. 250 units per mg solidRZ: Approx. 3.0Preliminary studies indicate the presence of two basic and no acidic isoenzymesP6140Peroxidase from Other Sources Product NameProduct # From Glycine max (Soybean)Lyophilized powder, Essentially salt freeSpecific Activity: 50–150 units per mg solidP1432From Arthromyces ramosusLyophilized powderSpecific Activity: min. 40 units per mg proteinP4794Chemically Modified HRP Product NameProduct # Stabilized Highly StabilizedLyophilized powder, Essentially salt freeSpecific Activity: 200–300 units per mg solidRZ: Approx. 3.0Stabilized by chemical protection of the primary amines.P2088Labeled Peroxidase Products Peroxidase–Biotinamidocaproyl ConjugateLyophilized powder, Contains sodium citrateSpecific Activity: Approx. 240 units per mg proteinP9568Peroxidase–Fluorescein Isothiocyanate LabeledLyophilized powder, Contains sodium citrateSpecific Activity: Minimum 200 units per mg solidStabilized by chemical protection of the primary aminesP2649Peroxidase–Rhodamine Isothiocyanate LabeledLyophilized powderSpecific Activity: Minimum 200 units per mg solidP5031Activated HRP for Conjugation Peroxidase–hydrazideLyophilized powder, Contains sodium chlorideSpecific Activity: 100–300 units per mg proteinUseful for the staining of glycoproteins and other glycoconjugates on protein blots, after periodate oxidation.P4542Peroxidase, Maleimide ActivatedLyophilized powder, Contains sodium citrate and trehaloseSpecific Activity: 200units per mg proteinFor direct conjugation to compounds containing free sulfhydryl groups for use as an enzyme–linked detection reagent.P1709Peroxidase Polymerized and Maleimide ActivatedLyophilized powder, Contains sodium citrate and trehaloseSpecific Activity: 200units per mg proteinFor direct conjugation to compounds containing free sulfhydryl groups for use as an enzyme-linked detection reagent.Polymerized peroxidase conjugates will generally demonstrate a significant increase in sensitivity over non–polymerized conjugates.P1834Inactivated Peroxidase, InactivatedSpecific Activity: 0.02 units per mg proteinReacts with goat and rabbit anti–peroxidase. May be used for developing differential staining techniques in nerve tissue preparations.P6278请教：制备腹水型单抗时，小鼠腹腔注射细胞后3-4天总会死亡，死了好几批了，细胞注射量减少也是同样结果，请教到底这是什么原因阿～～～～liefengwind wrote:我想用HRP标记已制备好的单抗，有两个问题想请教下：1.HRP选个公司的，sigma公司网站上有很多种，该选哪那种2.单抗纯化用G蛋白的柱子纯化影响大吗？ 1 P6782 不错 1,000 units per mg solid.2 可以用，请问是哪个亚类的？xiuxiu81 wrote:请教：制备腹水型单抗时，小鼠腹腔注射细胞后3-4天总会死亡，死了好几批了，细胞注射量减少也是同样结果，请教到底这是什么原因阿～～～～1 怎么进针得？2 细胞个数有多少？3 打石蜡油了吗？4 不知道是什么抗体？你好；想请教关于猪瓣膜的胶原蛋白含量的检测，用什么方法比较好？比较敏感？用什么样的试剂盒？及那个公司的谢谢。请问楼主的邮箱是多少，我有些问题想问你我的是fox_309@163.comcams2002@126.com请问自制的兔多克隆血清，效价比较低，怎样可以浓缩一下？你好由于试验需要，要对抗体进行生物素标记，但是自己又没有这方面的经验，你是否能够提供具体的操作步骤以及标记后的纯化方法谢谢～我的E－mail：huaningzhang1979@163.com你好！我现在在制备腹水型单抗，细胞数从3＊10＾6到0.5*10＾5都试过了，还是一样长实体瘤，请问是否是我细胞的原因呢，还是有可能是别的原因呢？谢谢！我要制备多克隆抗体，目前还没开始。请问多大的兔子开始免疫效果最好？免疫时是否是将抗原与福氏佐机剂1：1剂量混合注射？作夹心法ELISA，酶标多抗会和封闭的多抗或单抗直接反应，其中根本没有加入抗原，这是怎么回事？谢谢抗体特异性不好！偶想构建一人源化抗体，现抗体的可变区已获得，求教大伙有没有知道载体是怎样构建或到哪里能买到现成的载体，十分感谢，感激不尽！efeifan wrote:请问自制的兔多克隆血清，效价比较低，怎样可以浓缩一下？ 兔多克隆抗血清，需要在取血之前测定效价，达到要求的抗体效价后，才决定取血清。如果效价没有达到要求，需要对动物进行加强免疫。 如果现在效价比较低，那么也就是相对亲和力也比较低，浓缩并不能解决问题，当然，如果是因为血清抗体纯化后稀释造成的，则可以进行稀释。 方法：将纯化抗体放入透析袋，然后将透析袋上覆盖一层PEG8000,进行浓缩。也可以通过50％硫酸氨进行抗体沉淀，然后将抗体进行适当稀释。resana wrote:作夹心法ELISA，酶标多抗会和封闭的多抗或单抗直接反应，其中根本没有加入抗原，这是怎么回事？谢谢原因很多：1可能是如你所说，直接发生了反应。2酶标多抗可能会与封闭液成分发生了交叉反应。3没有封闭好ELISA板子4酶标多抗的浓度过高等。riboenzyme wrote:偶想构建一人源化抗体，现抗体的可变区已获得，求教大伙有没有知道载体是怎样构建或到哪里能买到现成的载体，十分感谢，感激不尽！市面上有一本"重组抗体"的书,里面应该可以找到答案。天香 wrote:本人从事单抗、多抗的制备，鉴定（Western Blot、抗体亚类测定等），纯化，抗体标记等，以及相关试剂盒的研发。另外胶体金、竞争ELISA等也有一定经验。非常乐于为大家解答问题！我也从事单克隆抗体研究，请问给老鼠腹腔注射阳性瘤细胞，过了一段时间老鼠腹腔内长满瘤子，取的腹水是红色的是怎么回事？feixzh wrote:我也从事单克隆抗体研究，请问给老鼠腹腔注射阳性瘤细胞，过了一段时间老鼠腹腔内长满瘤子，取的腹水是红色的是怎么回事？这种红色的腹水就是血性腹水了，可能的原因：瘤细胞形成的实体瘤过渡生长破裂，引起出血。也有可能就是你的阳性瘤细胞的性质有关；注射到小鼠体内的细胞量，石蜡油等稍微有关。 若是血性腹水需要尽量在第7-10天内取完腹水，否则，小鼠自身吸收后，就没有腹水了。天香 wrote:这种红色的腹水就是血性腹水了，可能的原因：瘤细胞形成的实体瘤过渡生长破裂，引起出血。也有可能就是你的阳性瘤细胞的性质有关；注射到小鼠体内的细胞量，石蜡油等稍微有关。 若是血性腹水需要尽量在第7-10天内取完腹水，否则，小鼠自身吸收后，就没有腹水了。再请问：一般液体石蜡和阳性细胞瘤多大量合适，注射时有没有特别的讲究？谢谢我想问一下怎么检测包被的效果。我包被的不是抗原，所以不能用抗体检测。我想问一下怎么检测包被的效果。我包被的不是抗原，所以不能用抗体检测。feixzh wrote:再请问：一般液体石蜡和阳性细胞瘤多大量合适，注射时有没有特别的讲究？谢谢 先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射0.5×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，让动物吃好饭。 注射的时候，用1ml的一次性注射器，可以将针头全部没入腹腔。但需要注意的是：动物头朝下，进针不要太快，确定针头进入腹腔。gyq21century wrote:我想问一下怎么检测包被的效果。我包被的不是抗原，所以不能用抗体检测。呵呵，能知道你包被的是什么吗？17β-雌二醇－BSA，谢谢！上一篇:Re:请问斑竹如何在附件贴文章下一篇:我是学日语专业的，已工作多年，有需要翻译帮助的（希望不太冗长:)），我愿意倾情帮忙，顺便~您的位置：医学教育网 医学资料
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单克隆抗体的制备这方面 对于一个新手请给一点建议 谢谢 请问一下抗体亚类测定的方法及原理? 以及辣根酶标记选用的中间连接物哪个好? 请问: 可不可以直接跑SDS-PAGE,然后将目...