m6A RNA甲基化如何轻松套路7分文章

 
m6A修饰无疑是2017年最火热的表观遗传研究！随着今年CNS上的多次报道，m6A也必将成为基金申请的新宠。今天小编就以一篇7分文章为例，教大家如何蹭上m6A修饰的热度。
 

这篇文章是印度一研究团队，于今年10月分发表的关于胶质瘤m6A修饰的研究，而在此之前，胶质瘤m6A在今年已有两篇高分文章。第一篇是芝加哥大学何川教授和美国希望城贝克曼研究所YanhongShi团队于3月份发表在CellReports上（IF=8.2）的“m(6)ARNAMethylationRegulatestheSelf-RenewalandTumOrigenesisofGlioblastomaStemCells.”主要阐述：m6A甲基转移酶METTL3和METTL14敲除，可诱导原癌基因ADAM19、EPHA3和KLF4mRNA的表达，促进GSCs的生长、自我更新和分化，而过表达METTL3或敲低去甲基化酶FTO则抑制生长和分化以及肿瘤的生长，延长GSC移植小鼠的寿命。
第二篇是何川与美国安德森癌症中心黄素云课题组于4月份发表在cancercell(IF=27.4)的“m(6)ADemethylaseALKBH5MaintainsTumorigenicityofGlioblastomaStem-likeCellsbySustainingFOXM1ExpressionandCellProliferationProgram.”主要阐述：m6A去甲基转移酶ALKBH5通过长链非编码RNAFOXM1-AS靶向FOXM1pre-mRNA-3’UTR，导致低甲基化，促进HuR（一个调节pre-mRNA剪接和表达的RNA结合蛋白）与FOXM1pre-mRNA的相互作用，增加FOXM1的表达，从而维持恶性胶质瘤干细胞的干性。
而这篇7分文章主要阐明m6A甲基转移酶METTL3通过结合SOX2-3’UTR，增加SOX2-3’UTR的m6A甲基化修饰，促进HuR与SOX2mRNA的结合，增强SOX2的稳定性，促进GSCs的干性维持和抗辐射。这篇文章，在研究内容和思路上与前两篇有重复之处，且不涉及临床样本，没有做m6A或RNA测序依然发表到7分杂志，除了研究m6A稳定mRNA的新机制和增加m6A对胶质瘤的抗辐射（DNA损伤修复），主要原因还是m6A的强大功能尚缺乏了解，易发高分文章。
 
文章具体思路：

1、筛选差异表达的m6A修饰蛋白，确定目标基因METTL3
利用Dotblot检测发现m6A抗体在胶质瘤干细胞（GSC）中高于分化的胶质瘤细胞（DGCs），通过数据库筛选差异表达的m6A修饰酶，并qPCR验证高表达的甲基化酶METTL3。Dotblot和数据库验证胶质瘤中METTL3与m6A的关系。

2、METTL3的细胞功能研究
构建稳定敲低METTL3的细胞系，细胞实验证明敲低METTL3可以显著抑制神经球的形成。

 
3、METTL3机制研究——靶mRNA筛选
确定表达和功能后，接下来就是具体机制研究。首先是寻找METTL3靶向的mRNA。高分文章往往通过敲除目标基因后进行m6A-seq和RNA-seq筛选靶基因，但该文章只对已报道的GSC特异性转录因子进行RIP-qPCR，筛选到较高结合METTL3和m6A抗体的SOX2。

 
4、METTL3机制研究——与靶基因的调控关系
 首先敲低METTL3，qPCR和WB检测SOX2在GSC中的表达变化，放线菌素D处理检测SOX半衰期变化；并检测不同细胞中METTL3和SOX2的表达相关性；回复实验验证SOX2过表达可逆转METTL3敲低造成的神经球形成减少。

5、METTL3机制研究——与靶基因的结合位点
作用位点筛选：m6A修饰主要发生在mRNA终止密码子附近和3’UTR，因此在SOX2-3′UTR寻找motif(GGACH)发现6个位点，再分析小鼠m6ARIP-Seq数据发现其中的三个位点。确定候选位点后，通过RNApulldown检测位点突变探针拉下的METTL3的变化，荧光素酶报告基因实验检测METTL3过表达对sox-3’UTR野生和突变型活性的影响。
 
6、METTL3机制研究——m6A稳定SOX2mRNA需依赖的蛋白
HuR是一个m6A修饰结合蛋白，其结合影响RNA稳定性和转录，且是胶质瘤生长和化疗抵抗所必须的。因此作者研究HuR敲低后METTL3过表达对SOX2mRNA表达的影响，及METTL3敲低后RIP检测HuR与SOX2mRNA的结合能力。并对HuR和m6A抗体进行免疫荧光共定位研究。

7、METTL3通过SOX2增强DNA修复
作者前面已研究METTL3胶质瘤干细胞干性维持的功能，接下来还研究METTL3通过SOX2增强辐射抵抗的功能。主要检测γ辐射后METTL3敲除对神经球体形成的影响，及METTL3敲除对DNA修复相关蛋白表达的影响。

8、动物模型研究证明METTL3敲低抑制肿瘤生长
  小鼠原位颅内肿瘤模型中，注射shMETTL3或shNT，检测肿瘤大小，sox表达，及小鼠生存时间。
 
以上便是别人已发相似的高分文章后，还能再发7分的文章套路。总的来说，m6A的课题设计可按以下套路进行：