Glycolipid Binding Assay

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Source:ContributedbyPingsunjim,Paller’sLab

Abstract:Thisprotocolcanbeusedforthedetectionofglycolipidsbindingtoimmunoprecipitedprotein.

Procedure A:Preparationofthecelllysate Rinsea60mmculturedishofconfluentcellswith10mMTris-HCl,PH7.4,0.15MNaCl,1mMMnCl2,and0.2mMPMSF. Lysethecellswith0.5mlcoldbuffer(10mMTris-HCl,PH7.4,0.15MNaCl,1mMMnCl2,3mMPMSF,and0.1MOctylglucoside) Maintainconstantagitationfor20minutesat4oC. Scrapethecellsfromthedishandcentrifuge(16,000xg,4oC)for15minutes,thesupernatantisthe"totalcelllysate". B:Immunoprecipitation Add4µgofantibody,400µlofH2O,400µgtotalproteintomicrocentrifugetube. Vortexandincubateat4celsiusdegreefor1Hr. Add10µl50%proteinA:Agrose,vortexandincubatefor30minutesat4oC. Centrifugetheagarosesolutionfor5minutes(16,000xg,4oC)anddiscardthesupernatant. Washwithlysisbuffer,bycentrifuging5minutes(16,000xg,4oC),repeatwashtwice. C:Thecrosslinkingofganglioside Add200-400µl50-100uMganglioside(dilutedinPBSfrom5mMinDMSOstockingsolution)tomicrocentrifugetube. Add2.5x10,000particlesof1uMFluospherebeads. Mixovernightat4oCwith200µl5mg/ml1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide. WashwithPBS,bycentrifuging,repeatwash3times. ResUSPendthebeadinPBSsolution. D:Thedetectionofproteinandgangliosidesbinding Add5-10µlFluoro-beadtomicrocentrifugetubewithimmunoprecipitatedprotein. incubate1Hratroomtemperature. WashwithPBSorlysisbufferfor3times. MonitorbyFluoro-microscope.