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克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可以使用以下的方法克隆目的基因： 1. PCR或RT-PCR法2. 从基因文库中分离基因3. 从cDNA文库中分离基因4. 转座子标签法5. 图位克隆法6. 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法7. 人工合成法本章中主要介绍从基因文库中筛选目的基因的几种方法。获的目的克隆的方法有两种1） 目的基因的直接选择2） 从基因文库中筛选称为鸟枪射击法，建立一个包含所有基因或大部分基因的克隆，从中筛选目的克隆。一、直接选择 直接选择的基因比较少，如抗生素抗性基因。如克隆一个kan抗性基因，在R6-5质粒上含有四种抗性基因：kan, 氯霉素、链霉素、硫胺类药物，kan抗性基因存在于13个EcoRI片段中的一段中。将R6-5的片段插入pBR322的EcoRI位点中，连接混合物中将含有13个不同片段的大量重组拷贝，其中部分是kan抗性的。只有含kan的克隆才能在含有kan的培养基上正常生长。1.1 标记援救可以扩大直接选择的范围 利用E. coli的突变系可扩展该项技术。例如要从E. coli中克隆trpA基因，编码色氨酸合成酶，一个突变系不能合成色氨酸，只有加入色氨酸后才能存活。因此E. coli的突变体可以用来克隆trpA基因。首先从一个正常个体中提取总DNA，然后酶切，连接产生大量重组DNA分子，其中一个将携带完整的trpA基因。连接混合物用来转化缺陷型E. coli细胞，大部分转化子是缺陷型的，携带trpA的重组子将是野生型的，可以在基本培养基上生长。 图5-1 直接选择法克隆Kan抗性基因 1.2 标记援救的范围和限制 存在两个限制因素： 1） 必须存在着目的基因的突变品系 2） 需要一种只有野生型能够生长的培养基。 一般而言，标记援救适用于微生物的合成酶，可以在基本培养上选择。 图5-2 标记拯救法克隆trpA基因
