SYNTHETISCHE ANTIBIOTIKA CERES TECHNOLOGIES INC

Hintergrund der ErfindungA. Gebiet der Erfindung

DieseErfindung betrifft synthetische chemische Zusammensetzungen undVerfahren zur Prüfungsolcher Zusammensetzungen, um zu ermitteln, welche dieser Zusammensetzungendas Pilzwachstum hemmen. Die Zusammensetzungen der Erfindung können verwendetwerden, um Pilzschädenan landwirtschaftlichen und gartenwirtschaftlichen Nutzpflanzen,insbesondere an Samen, Keimlingen und landwirtschaftlichen Waren,einschließlichreifer Pflanzen, wie Bäumen,zu verhindern, einzuschränkenoder anderweitig zu behandeln. Manche der Zusammensetzungen undVerfahren der Erfindung könnenverwendet werden, um nichtpflanzliche Pilzkrankheiten, wie diejenigenvon Tieren einschließlichdes Menschen, zu behandeln. Die Zusammensetzungen der Erfindungsind besonders nützlich,wenn die Bedingungen fürdie Entwicklung einer Pilzkrankheit förderlich sind und wenn dieBekämpfungdes Pilzwachstums bevorzugt mit Zusammensetzungen bewerkstelligtwird, welche fürNicht-Pilz-Zellen nicht toxisch sind.

B. Beschreibung des betroffenen Fachgebiets

EinhäufigesProblem in der Landwirtschaft ist der verringerte Ertrag und dieErnteausfälle,welche durch pflanzenpathogene Mikroorganismen verursacht werden.Zum Beispiel verringerten im Jahre 1992 in Texas durch pflanzenpathogeneMikroorganismen herbeigeführteKrankheiten von Reis, Sojabohnen und Baumwolle die Erträge des Staatesum schätzungsweise15%, 13% bzw. 27%. Zusätzlichzu Feldnutzpflanzen-Verlusten treten auch krankheitsbedingte Verlustebei gartenwirtschaftlichen Pflanzen und Forstbäumen auf. Nach der Ernte erfolgendePilzkontamination kann ebenfalls zur Verringerung von Erträgen undNach-Ernte-Werten von Pflanzenerzeugnissen führen. Derzeitige Strategienzur Bekämpfungvon Erkrankungen beinhalten das Anbauen resistenter Kultivare unddie Verwendung bekannter Pestizide und Fungizide.

Unglücklicherweisezeigen viele der effektivsten antifungalen (Anti-Pilz-)Chemikalieneine unerwünschtePersistenz in der Umwelt. In anderen Fällen besitzen derartige Chemikalieneine geringe Spezifität hinsichtlichdes Zielorganismus. Wo Nicht-Ziel-Organismen durch derartige Chemikalienmit geringer Spezifität beeinträchtigt werden,ist es nicht ungewöhnlich,eine unerwünschtebiologische Aktivitätzu beobachten, einschließlichToxizitätgegenüberdem Menschen (Teratogenität,Mutagenität,Karzinogenitätetc.). Öffentliche Bedenkengegenüberdem Einsatz von Fremdchemikalien in der Umwelt liefern einen starkenAntrieb fürdie Entwicklung alternativer Verfahren der Pilzbekämpfung.

Häufige landwirtschaftlichePilzinfektionen schließensowohl vaskuläreals auch nicht-vaskuläre Krankheitenein. Soweit es nicht-vaskuläreKrankheiten betrifft, könnenZustände,wie Keimlingsfäulebzw. \"Damping-off\" und Wurzelverrottung,auftreten. Das \"Damping-off\" (ein Symptom einesPathogen-Angriffs auf Samengewebe, z. B. eines Pilzbefalls) findetals ein Ergebnis der Schädigungvon Samen und Keimlingswurzeln währendder Auskeimung, entweder vor oder nach dem Austreten bzw. der Emergenzaus dem Erdreich, statt. Von Keimlingsfäule betroffene Samen treibennicht aus, werden weich, schrumpfen und zerfallen schließlich. Post-Emergenz-Wurzelverrottungwegen der Pathogeninfektion von Pflanzengewebe ist ebenfalls für große Verminderungender Lebensfähigkeitvon kultivierten Pflanzen verantwortlich.

ZurBekämpfungdes \"Damping-off\" und der Wurzelverrottungwurde der Versuch unternommen, resistente Pflanzen zu züchten, wasmit wechselndem Erfolg verbunden war. Allerdings wurden keine vollständig resistentenKultivare entwickelt und mikrobielle Krankheiten bleiben eine Hauptursachefür Ernteausfälle. DieserAusfall ist besonders in feuchten Wachstumsumgebungen offensichtlichoder dort, wo Nutzpflanzen wiederholt auf den gleichen Feldern angebautwerden. Verbesserte Kulturpraktiken haben zwar einen gewissen Nutzen,bieten aber ebenfalls keine ausreichende Entlastung.

BeispielsweiseBananen (Musaceae-Familie) sind die weltweit wichtigste tropischeFrucht mit einer jährlichenProduktion von über62 Millionen Tonnen (bei Berücksichtigungvon Mehlbananen). Fürein angemessenes Wachstum dieser großen mehrjährigen krautigen Pflanze sindeine konstant hohe Feuchtigkeit und tropische Temperaturen erforderlich(16-35°C). Die gleichenBedingungen sind ebenfalls in hohem Maße für die Hauptkrankheiten derBananen-Panamakrankheit, Sigatokakrankheit, Schwarzblatt-Streifen/Schwarz-Sigatoka, Moko-Krankheit,Schwarzkopf- bzw. -\"Blackhead\"-Krankheit und dasBananen-\"Bunchy Top\"-Virus förderlich.Die Panama-Krankheit wird durch Fusarium oxysporum f. sp. cubense(Rassen 1, 2 und 4) verursacht. Schwarzblatt-Streifen/Schwarz-Sigatokawird von Mycosphaerella fijiensis verursacht. Die Moko-Krankheit wirddurch Pseudomonas solanacearum verursacht.

Diebiologische Bekämpfungvon Pilzkrankheiten bei Pflanzen ist der Gegenstand früherer Untersuchungengewesen; siehe zum Beispiel die verwandten U.S.-Patente Nr. 4 942 032 und 4 906 611. Diese Patenteoffenbaren die Herstellung und Verwendung eines natürlich vorkommendenAnti-Pilz-Produktes (\"AFP\" bzw. AntifungalesProdukt), hergestellt aus Pediococcus-Spezies zur Bekämpfung vonNach-Ernte-Krankheiten, einschließlich Mucor-Verrottung, Grauschimmelund Blauschimmel auf Obst. Das U.S.-Patent Nr. 5 244 680 offenbartdie Verwendung verschiedener Spezies von Cryptococcus, um das Verderbender Früchtenach der Ernte zu verhindern. Das U.S.-PatentNr. 5 049 379 offenbart die Verwendung eines aus Bacilluscereus isolierten Fungizids oder die Verwendung des Organismus selbstzur Bekämpfungeiner Infektion von bestimmten Hülsenpflanzendurch Phytophthora megasperma f. sp. medicaginis und Phytophthoramegasperma f. sp. glycinea. Die Verwendung von mikrobiellen Wirkstoffenzur Inhibierung des Wachstums von pathogenen Pilzen ist jedoch starkenEinschränkungenunterworfen. Die antagonistischen Effekte des Bekämpfungsmittels sindabhängigvon der Etablierung und dem Wachstum dieses Wirkstoffs in der besonderen ökologischenNische, in welcher das Pathogen gefunden wird. Sowohl abiotischeals auch biotische Faktoren könneneine derartige Etablierung und ein anschließendes Wachstum des antagonistischenMikroorganismus beeinflussen, was wiederum die Herstellung des Anti-Pilz-Mittelsbeeinflusst.

WeitereForschungsarbeiten richteten sich auf die Isolierung von natürlich-vorkommendenAnti-Pilz-Verbindungen aus Pseudomonas-Spezien. Ein Isolat aus Pseudomonas,L-22-64, und Hefe, F-43-31, ist in der Lage, Blauschimmel auf Äpfeln zubekämpfen;W. J. Janisiewicz, Phytopathology 78:194-198 (1988). Das Anti-Pilz-Mittelist als Pyrrolnitrin identifiziert worden; W. J. Janisiewicz undJ. Poitmann, Phytopathology 78:1697-1700 (1988). Weitere Beispielevon natürlicherzeugten Verbindungen, die eine Anti-Pilz-Aktivität aufweisen, sind u.a.: Phenazin,Phloroglucinol und Pyoluteorin. In vielen Fällen wurde die aktive Komponenteder natürlichenAnti-Pilz-Mittel weder identifiziert noch vollständig charakterisiert. Da vieledieser natürlicherzeugten Anti-Pilz-Mittel bestenfalls schlecht charakterisiertsind, sind die Persistenz und die Toxizität dieser Verbindungen in derUmwelt unbekannt. Darüberhinaus legt die Tatsache, dass diese Verbindungen durch Mikroben inder Umwelt erzeugt werden, nahe, dass sie ein begrenztes Spektruman antimikrobieller Aktivitätaufweisen könnten.

Peptidesind Effektoren einer Vielzahl von physiologischen Vorgängen undkönnenals anti-mikrobielle Mittel wirken, die das Wachstum von Pilzenund anderen mikrobiellen Zellen inhibieren. Mehrere cysteinreiche Anti-Pilz-Peptidesind aus Rettichsamen isoliert worden. Diese Peptide, welche eineLänge imBereich von 23 bis 30 Aminosäurenaufweisen, besitzen verschiedene antifungale Aktivitäten gegenAlternaria brasicola, Botrytis cinerea, Fusarium culmorum, Pyriculariaoryzae, Fusarium oxysporum und Verticillium dahliae; Terras et al.,FEBS Letters 316, 233 (1993); Terras et al., J. Biol. Chem. 267,15301 (1992). Cysteinreiche Peptide sind auch aus den Samen vonMirabilis jalapa isoliert worden. Diese Peptide besitzen Anti-Pilz-Aktivität gegenAlternaria brassicola, Ascochyta pisi, Botrytis cinerea, Cercosporabeticola, Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium culmorum, Fusariumoxysporum, Nectria haematocca, Phoma betea, Pyrenophora tritici-repentis,Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae undVenturia inaequails. Die Peptide inhibierten auch das Wachstum einigergrampositiver Bakterien; B. P. A. Cammue, J. of Biol. Chem. 267,2228 (1992). Andere cysteinreiche Peptide sind aus den Samen vonAmaranthus caudatus isoliert worden; W. F. Broekaert et al., Biochemistry31, 4308 (1992). Allerdings wird der Cysteingehalt dieser Peptidebei synthetischer Herstellung wahrscheinlich zu einer Polymerisationdes Monomerpeptids zu Aggregaten von zwei oder mehreren Monomerenführen.Diese Aggregate besitzen eine unbekannte Anti-Pilz-Aktivität. Somitkann die Aggregatbildung zu variablen Niveaus von Aktivität und Spezifität führen.

Anderenatürlichvorkommende antifungale Peptide sind umfassender charakterisiertworden. Ein Derivat eines Dipeptids (\"Nitropeptin\") mit einer wachstumshemmenden Aktivität gegenPyricularia oryzae ist isoliert worden. Das Dipeptid wurde aus Streptomycesxanthochromogenus aufgereinigt; K. Ohba et al., The Journal of Antibiotics40, 709-713 (1986). Man nimmt an, dass Nitropeptin ein kompetitiverInhibitor des Glutaminsäure-Stoffwechselsbei der Proteinsynthese ist. Als solcher ist es nicht wahrscheinlich,dass es in nährstoffreichenWachstumsbedingungen oder bei Organismen mit Fähigkeiten zur Biosynthese vonGlutaminsäureein effektives antimikrobielles Mittel ist. Für ein natürlich abgeleitetes zyklischesDecapeptid, Calophycin, wurden ebenfalls antimikrobielle Eigenschaftennachgewiesen; S.-S. Moon, J. Org. Chem. 57, 1097 (1992). Es wurde herausgefunden,dass das Peptid mehrere modifizierte Aminosäuren, einschließlich einesD-Asparaginsäurerestesund eines N-Methyl-Asparaginrestes, und einen Fettsäurerest[(2R,3R,4S)-3-Amino-2-hydroxy-4-methylpalmitinsäure] enthält. Allerdings sind zyklischePeptide wegen der Zyklisierungschemie schwierig in hoher Reinheitund/oder in hohen Ausbeuteraten zu synthetisieren. Darüber hinausist gezeigt worden, dass Anti-Pilz-Peptide von Bacillus subtilisdie Braunfäulebei Pfirsichen bekämpfen;CG. Guelderner et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry36:366-370 (1988). Natürlichvorkommende Peptide, wie Nisin, sowie natürlich vorkommende antibiotischeSäuren,wie Propionsäure,sind zur Nahrungsmittelkonservierung verwendet worden. Allerdingssind die Umweltstabilitätund die Toxizitätendieser natürlichvorkommenden Verbindungen im Allgemeinen unbekannt. Wo derartigeAnti-Pilz-Mittel aus natürlichenQuellen abgeleitet werden, wird darüber hinaus typischerweise lediglichdas eine oder das andere Stereoisomer die gewünschte antifungale Aktivität aufweisen.

DerNutzen der Verwendung natürlicherantifungaler Produkte, die in kommerzieller Menge aus Mikroorganismenisoliert werden, ist hauptsächlichwegen aufreinigungsbedingten Problemen beschränkt. Zur Aufreinigung des Anti-Pilz-Produktesist eine Zellkultur des das Anti-Pilz-Mittel herstellenden Mikroorganismusin großemMaßstaberforderlich. In vielen Fällenist das Kulturisolat, das fürdie Herstellung des antifungalen Mittels verantwortlich ist, keinIsolat, welches ohne Weiteres ansatzweise kultiviert werden kann,oder es ist vollständigungeeignet zur Kultivierung als Charge (z. B. obligate Pathogene).Darüberhinaus sind häufigkomplizierte Aufreinigungsstrategien erforderlich, um das aktiveProdukt zu einem vernünftigenHomogenitätsgrad aufzureinigen.Ein wesentlicher Nachteil der Verwendung von natürlich-abgeleiteten antifungalenMitteln ist die möglicheMit-Aufreinigung unerwünschtermikrobieller Nebenprodukte, insbesondere Nebenprodukte, welche inunerwünschterWeise toxisch sind. In vielen Fällenführendiese Faktoren zu hohen Produktionskosten und machen eine Isolierungvon Anti-Pilz-Produkten aus natürlichenIsolaten im großenMaßstabunpraktisch. Aufreinigungen könnennoch schwieriger sein, wo razemische Gemische möglich sind, bei denen nur eineinzelnes Stereoisomer aktiv ist, oder wo Disulfidverbindungen zwischenPeptidmonomeren möglichsind.

DieSuche nach antimikrobiellen Produkten zur Anwendung in der Landwirtschaftist hinter der Suche nach solchen Produkten in der Humanmedizinzurückgeblieben.Beispielsweise sind synthetische Peptide als nützliche Forschungswerkzeugebei der Entwicklung von Impfstoffen in der biomedizinischen Forschungin den Vordergrund getreten; Pinilla, C, et al., Vaccines 92,25(1992). Derartige Peptide sind verwendet worden, um Details vonAntigen-Antikörper-Wechselwirkungenaufzuklären(Lerner, R. A. Nature 299,592 (1982)), um Proteinprodukte von gehirnspezifischenGenen zu kartieren (Gramsch, C, et al., Neurochem. 40:1220 (1983)) undum optimale Analoga von biologisch aktiven Peptiden herzustellen(Cull. M. G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,865 (1992),Furka, A. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 37:487 (1991)) undsie sind in Mikroverdünnungs-Assaysfür dieEntwicklung neuer antimikrobieller Peptide (gegen S. aureus, P.aeruginosa, C. albicans) (Houghten, et al., 1991; Houghten, et al.,1992a) verwendet worden.

Dasdurch Bezugnahme zu einem Bestandteil der vorliegenden Schrift gemachte U.S.-Patent Nummer 5 254 535 offenbartdie Verwendung von Peptiden und Peptidderivaten zur Verstärkung derEffekte von Antibiotika, welche in standardmäßigen antimikrobiellen Therapieneingesetzt werden. Die verwendeten Peptide hatten eine Länge von14-50 Resten, eine zwingend amphiphilische Natur und besitzen derVorhersage nach Ionenkanal-bildende Merkmale. Es wird vorgeschlagen,dass diese Peptide destabilisierend auf Zellmembranen wirken können. Dieoffenbarten Peptide sind aus tetrameren Sequenzen von definiertenMotiven aufgebaut. Das Motiv schließt zwei benachbarte hydrophobeReste und mindestens einen basischen Rest ein, während der verbleibende Restentweder basisch oder neutral sein kann. Die hydrophoben Reste sindzwingendermaßenzusammen lokalisiert. Währenddie Wirkungsweisen von bestimmten Peptiden bestimmt worden sind(siehe z. B. Fiedler et al., 1982; Isono und Suzuki, 1979), sindMechanismen, welche den Wirkmechanismus und die Spezifität solcherPeptide erklären,typischerweise nicht bestimmt worden. Wo derartige Untersuchungenin der Pilzforschung durchgeführtworden sind, bezogen anfänglicheUntersuchungen zur Bestimmung der Anti-Pilz-Wirkungsweise von Peptideneine physikalische Untersuchung von Mycelien und Zellen ein, umzu bestimmen, ob die Peptide Membranfunktionen, welche für das osmotischeGleichgewicht verantwortlich sind, stören konnten, wie es bei anderenPeptiden beobachtet worden ist (Zasloff, M. 1987, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 84:5449-5453). Andere potenzielle Wirkungsweisen könnten Störungen derSynthese oder des Stoffwechsels von Makromolekülen beinhalten.

Das U.S.-Patent Nummer 5 126 257 offenbartdie Isolierung und Verwendung eines natürlich vorkommenden Peptids,das aus Extrakten von lysierten humanen polymorphonuklearen Leukozytenabgeleitet ist. Der aktive Wirkstoff tötet grampositive und gramnegativeBakterien ab. Allerdings ist seine Aktivität gegen Pilze nicht bekannt.Das U.S.-Patent Nummer 4 725576 offenbart die Verwendung von Peptiden zur Bekämpfung vonPilzinfektionen. Die Peptide enthalten mindestens 14% Histidin.Es werden spezifisch Histidin-Hexamere offengelegt, die Candidaalbicans- und Streptococcus mutans-Infektionen bekämpfen können.

Kürzlich entwickelteVerfahren gestatten die Herstellung von kombinatorischen Bibliothekenvon synthetischen Peptiden (\"SPCLs\" bzw. synthetic Peptidecombinatorial libraries), welche aus äquimolaren Mischungen freierPeptide aufgebaut sind, welche mit In-vitro-Verfahren zur Bestimmungder biologischen Aktivitäteingesetzt werden können(Furka, A., et al., Int. J. Pept. Protein Res. 37:487 (1991), Houghten,R. A., et al., Nature 354:84 (1991), Houghten, R. A., et al., BioTechniques13:412 (1992). Die Bibliotheken können aus D- oder L-Aminosäure-Stereoisomerenoder Kombinationen aus L- und D- und/odernicht-natürlich-vorkommendenAminosäurenbestehen. Andere Verfahren fürdie Synthese von Peptiden mit definierter Sequenz sind ebenfallsbekannt. In ähnlicherWeise sind großmaßstäbliche präparativeVerfahren bekannt. Bestimmte rekombinante Verfahren zur Herstellungvon Peptiden sind ebenfalls bekannt; siehe z. B. das U.S.-Patent Nr. 4 935 351. Die PCT-Anmeldungmit der Publikationsnummer WO9608264 legtdie Verwendung von Bibliotheken zur Identifizierung von neuen Verbindungen(Orphan Compounds), die als Inhibitoren des Pilzwachstums geeignetsind, offen. Die Sequenzen 32 bis 47 werden in dieser Schrift jedochnicht offen gelegt.

DieVerwendung der zurzeit vorhandenen Zusammensetzungen zur Bekämpfung vonPilzpathogen-Infektionen wird durch ihre geringe Spezifität, die Toxizität für den Menschenund die Persistenz in der Umwelt beschränkt. Und trotzdem besteht wegendes Unvermögens,das Pilzwachstum durch das Züchtenvon Resistenz und durch Kulturpraktiken ausreichend zu bekämpfen, einBedarf zur Entdeckung von antifungalen Mittel, die derartige unerwünschte Eigenschaftennicht aufweisen. Die Verwendung von Mikroben zur Bekämpfung vonPilzwachstum in der Umwelt ist schwierig. Der Nutzen der Verwendungvon natürlichenAnti-Pilz-Produkten, die in kommerzieller Menge aus Mikroorganismenisoliert werden, ist ebenfalls beschränkt, hauptsächlich wegen Aufreinigungsproblemen,insbesondere wenn razemische Mischungen aufgereinigt werden müssen. Darüber hinausist die Suche nach natürlicherzeugten Anti-Pilz-Mitteln ein sehr zeitaufwendiger Vorgang miteiner sehr geringen Erfolgswahrscheinlichkeit. Selbst wenn derartigenatürlichvorkommenden Peptide lokalisiert werden, kann die Synthese des Peptidesproblematisch sein (z. B. Disulfidbildung, hohe Histidin-Anforderungenetc.). Es werden Verfahren und Zusammensetzungen benötigt, dieMittel fürdie einfache Synthese und Prüfungvon Anti-Pilz-Zusammensetzungen bereitstellen, welche nicht dengleichen Einschränkungen wienatürlichvorkommende Peptide unterliegen.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG DERERFINDUNG

Dievorliegende Erfindung überwindetdie Nachteile von bereits bekannten Fungiziden dahingehend, dassdie Zusammensetzungen der Erfindung chemisch definierte Speziessind, die leicht zu synthetisieren und aufzureinigen sind. Sie sindbei ihrer Herstellung nicht von der genetischen Stabilität oder denWachstumseigenschaften von Mikroorganismen abhängig. Eine antimikrobielleBehandlung unter Verwendung der Zusammensetzungen und Verfahrender Erfindung erfordert nicht das Kontaktieren einer landwirtschaftlichenWare mit unberechenbaren lebendigen Mikroben. Darüber hinausstellen die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindungeine Reihe von unterschiedlichen antibiotischen Verbindungen bereit,die nachweislich eine besondere Wirksamkeit bei der Behandlung vonPilzerkrankungen von Pflanzen und Tieren aufweisen.

DieZusammensetzungen der Erfindung sind wirksam zur Bekämpfung vonPilzpathogen-Infektionen undzeigen dennoch einen hohen Grad an Spezifität für die Ziel-Pilze, niedrigeToxizitätund eine kontrollierte Persistenz in der Umwelt. Durch Anwendungder Verfahren der Erfindung ist es möglich, Anti-Pilz-Mittel ineiner viel kürzerenZeit und mit einer beträchtlichhöherenErfolgswahrscheinlichkeit herzustellen, als beim Screening natürlicherIsolate hinsichtlich einer solchen Aktivität. Da die chemischen Eigenschaftender so hergestellten Anti-Pilz-Mittel bei den Verfahren der Erfindungkontrolliert werden können,gestalten sich sowohl die Synthese aus auch die Aufreinigung derPeptide wesentlich weniger problematisch (z. B. wird Cystein eliminiert).

Zusammensetzungendieser Erfindung umfassen Peptide mit bekannter chemischer Strukturund bekannten Eigenschaften. Die Verwendung von D-Aminosäuren erhöht die Stabilität bestimmterdieser Verbindungen durch Unempfindlichkeit gegenüber üblichenbiologischen Abbauwegen, welche L-Aminosäure-Peptide abbauen. Zum BeispielkönnenL-Aminosäure-Peptidedurch Hinzufügenvon D-Aminosäurenan einem oder beiden der Peptidenden stabilisiert werden. Allerdingsgibt es biochemische Wege, welche sogar D-Aminosäuren in diesen Peptiden abbauenwerden, so dass eine Langzeit-Persistenz in der Umwelt kein Problem darstellt.Wenn die Zusammensetzungen der Erfindung rasch wirken oder nichtanderweitig stabilisiert werden müssen, können selbstverständlich L-Aminosäuren oderMischungen aus L- und D-Aminosäurennützlichsein. Anders als Anti-Pilz-Mittel,welche lediglich als das eine oder das andere Stereoisomer Wirkungzeigen, funktionieren die Zusammensetzungen der Erfindung gut sowohlals entweder das eine oder das andere Stereoisomer als auch alseine gemischte stereoisomere Zusammensetzung.

Diezu der vorliegenden Erfindung führendenForschungen überprüften SPCLshinsichtlich Aktivität gegenPilzpathogene, wobei sowohl Pathogene von Pflanzen als auch vonTieren eingeschlossen waren. Die Bibliothek war aus 52 128 400 Sechs-Reste-Peptidenaufgebaut, wobei jedes Peptid aus D-Aminosäuren zusammengesetzt war undnicht-acetylierte N-Terminiund amidierte C-Termini aufwies. Ein iteratives Verfahren wurdeangewandt, um aktive Peptidsequenzen mit einem breiten antifungalenAktivitätsspektrumzu identifizieren. Bei dem Verfahren wurde eine Hexapeptid-Bibliothekverwendet, wobei die ersten zwei Aminosäuren in jeder Peptidkette individuellund spezifisch definiert waren und wobei die letzten vier Aminosäuren aus äquimolarenMischungen von 20 Aminosäurenbestanden. Vierhundert (400) (202) unterschiedlichePeptidmischungen, jeweils bestehend aus 130 321 (194)(Cystein war eliminiert) individuellen Hexameren wurden ausgewertet.In einem solchen Peptidgemisch war die Endkonzentration für jedesPeptid 9,38 ng/ml in einer Mischung, zusammengesetzt aus 1,5 mg(Peptidgemisch)/ml Lösung.Bei diesem Mischungsprofil wurde die Annahme gemacht, dass ein durchschnittlichesPeptid ein Molekulargewicht von 785 aufweist. Diese Konzentrationwar ausreichend, um die Prüfungder Bioaktivitätzu gestatten. Anschließendwurden sowohl D- als auch L-Aminosäure-enthaltende Peptide konstruiertund getestet.

DieErfindung offenbart Peptidzusammensetzungen, die Pilz-Pathogenebekämpfenkönnen,hauptsächlichdiejenigen von Pflanzen. Die Zusammensetzungen der Erfindung umfasseneine Mischung von Peptiden, die sich von Aminosäuren ableiten, mit einer Länge vonsechs Resten. Andere Zusammensetzungen der Erfindung schließen im Wesentlichenhomogene Peptidzusammensetzungen ein, die als antimikrobielle Mittel nützlich sind.Weitere Zusammensetzungen von Interesse in der Erfindung schließen Peptidzusammensetzungenein, welche zur Anwendung formuliert sind, wie diejenigen, welchein Mikrokügelchenenthalten sind.

DiePeptide der Erfindung könnenunter Verwendung einer Vielzahl von Aminosäurevorläufern konstruiert werden. Selbstverständlich können diePeptide homogene Zusammensetzungen sein, die lediglich D-, L- oderzyklische (nicht-razemische)Aminosäurenenthalten. Die chemische Struktur solcher Aminosäuren (wobei der Begriff hierinunter Einschluss von Iminosäurenbenutzt wird), ungeachtet der stereoisomeren Konfiguration, kannauf derjenigen der neunzehn oder zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren basieren: Alanin(Ala; A), Arginin (Arg; R), Asparagin (Asn; N), Aspartat (Asp; D),Glutamin (Gln; Q); Glutamat (Glu; E), Glycin (Gly; G); Histidin(His; H), Isoleucin (Ile; I), Leucin (Leu; L), Lysin (Lys; K), Methionin(Met; M), Prolin (Pro; P), Phenylalanin (Phe; F), Serin (Ser; S),Threonin (Thr; T), Tryptophan (Trp; W), Tyrosin (Tyr; Y), und Valin(Val; V). Cystein (Cys; C) ist ausgeschlossen, um Disulfidverknüpfungs-Problemein den Produkten zu verhindern. Die Zusammensetzungen der Erfindungkönnenauch nicht-homogen sein, enthaltend beispielsweise sowohl D-, L- und/oder zyklischeAminosäuren.Die Peptidzusammensetzungen könnenauch Aminosäurenenthalten, die nicht zu den natürlichvorkommenden Aminosäurengehören,wie Norleucin, etc.

Genauergesagt werden die Zusammensetzungen der Erfindung eine aus der Gruppevon Peptiden sein, die in Sequenz ID Nrn. 32-47 offengelegt sind.Diese Sequenzen und die Sequenz ID Nrn. 1-31 (die für Vergleichszweckebeschrieben werden) bilden eine Anzahl von genauen chemischen Zusammensetzungen, für die eineAnti-Pilz-Aktivitätgegen ein Spektrum von Pilzen nachgewiesen wurde. In gewissen Fällen werden diePeptide der Sequenz ID Nrn. 1-47 vollständig definierte Sequenzen aufweisen.

Inanderen Fällenwird die Sequenz der antifungalen Peptide nur für bestimmte der C-terminalen Aminosäurerestedefiniert sein, wobei die verbleibenden Aminosäurereste als äquimolareVerhältnissedefiniert belassen werden. Somit werden in jedem Aliquot (Teilmenge)der SPCL, die eine gegebene Sequenz ID Nr. enthält, die einen variablen Restenthält,die variablen Reste jeweils einheitlich in äquimolaren Mengen durch einevon neunzehn verschiedenen natürlichvorkommenden Aminosäurenin einer oder der anderen stereoisomeren Form repräsentiertwerden. Allerdings könnendie variablen Reste unter Anwendung der Verfahren der Erfindungschnell definiert werden, um die effektivsten Peptide zur Bekämpfung vonPilzwachstum zu ermitteln.

Folglichist in den nachfolgenden Vergleichsbeispielen ersichtlich, dassdie C-terminale Sequenz \"FRXXXX\" (Seq. ID Nr. 1)eine antifungale Aktivitätfür einbreites Spektrum an Pilzen aufwies. Zur einfacheren Bezugnahme werdenPeptide hierin routinemäßig in einerRichtung vom C-Terminus zum N-Terminus geschrieben, um die Abfolgeder Synthese anzugeben. In den Sequenzlisten wird dagegen die herkömmlicheArt der Aufzeichnung von Aminosäuresequenzenvom N-Terminus zum C-Terminus verwendet. Diese relativ variableZusammensetzung kann deshalb als eine antibiotische Zusammensetzungder Erfindung beschrieben werden, obwohl die Wahrscheinlichkeitbesteht, dass nicht jede Komponente der gemischten Peptidzusammensetzungantibiotische Aktivitätbesitzt. In der nächstenRunde der Identifizierung von antibiotischen Peptidzusammensetzungenbasierend auf der Elternzusammensetzung \"FRXXXX\" (Seq. ID Nr. 1) mit bekannter antibiotischerAktivitätwurde festgestellt, dass \"FRLXXX\" (Seq. ID Nr. 9)-Peptidzusammensetzungeneine signifikante antibiotische Aktivität zeigen. Ähnlich wie die Elternzusammensetzung \"FRXXXX\" (Seq. ID Nr. 1) wirddie Peptidzusammensetzung \"FRLXXX\" (Seq. ID Nr. 9)eine gemischte äquimolareMenge von Peptiden aufweisen, welche die gleichen neunzehn Aminosäureresterepräsentieren,von denen manche antibiotische Aktivität besitzen können undvon denen einige keine derartige Aktivität besitzen können. Insgesamtist jedoch die Peptidzusammensetzung \"FRLXXX\" (Seq. ID Nr. 9) selbst eine antibiotischeZusammensetzung der Erfindung. Dieses Verfahren kann bis zu demPunkt durchgeführtwerden, an dem vollständigdefinierte Peptide erzeugt und mittels der Verfahren der Erfindungauf ihre antibiotische Aktivitätgetestet werden. In diesen Fällen,wie beispielsweise für \"FRLHF\" (Seq. ID Nr. 31)erfolgt ist, werden alle Aminosäurerestein einem Peptid mit sechs Resten bekannt sein.

Esist jedoch nicht notwendig, dass eine Peptidzusammensetzung mitnachweisbarer antibiotischer Aktivität auf jeden Rest genau vollständig definiertist. Tatsächlichwerden in bestimmten Fällengemischte Peptidzusammensetzungen bevorzugt sein, insbesondere beidenen die Peptidzusammensetzungen der Erfindung speziell zur Behandlungeiner Reihe von Pilzkrankheiten, eine jede mit einem unterschiedlichenauslösendenAgens, verwendet werden. Dies ist wahrscheinlich auch der Fall,wenn der Wunsch besteht, eine Pilzerkrankung bei einer Pflanze ehermit niedrigeren Konzentrationen von zahlreichen Antibiotika anstatteiner höherenKonzentration einer einzelnen chemischen Zusammensetzung zu behandeln.In anderen Fällen,wo sich beispielsweise aufgrund der erhöhten Kosten für die Testungund die Herstellung ein vollständigdefiniertes Peptid-Antibiotikumverbietet, könnendie gemischten Peptidzusammensetzungen der Erfindung mit einem odermehreren variablen Aminosäurerestenbevorzugt sein. Somit wurden antibiotische Zusammensetzungen, dieeine äquimolareMischung von Peptiden umfassen, die in einer kombinatorischen Bibliothekvon synthetischen Peptiden unter Anwendung der Verfahren der Erfindunghergestellt wurden, abgeleitet worden, und besitzen nachweislicheine wünschenswerteantibiotische Aktivität.Diese relativ variablen Zusammensetzungen sind genau gesagt diejenigen,welche auf der Sequenz eines der Peptide der Seq. ID Nrn. 1-24 basieren. (zum Vergleich)

Dieantibiotischen Zusammensetzungen der Erfindung können auch einen Träger umfassen.Der Trägerwird ein solcher sein, der zur Verwendung beim Aufbringen der antibiotischenZusammensetzungen auf Pflanzen geeignet ist. In jedem Fall mussder gewählteTrägerein Trägersein, dessen chemische und/oder physikalische Eigenschaften dieantibiotische Aktivitätder Peptidzusammensetzung nicht wesentlich stören. Es ist beispielsweisebekannt, dass bestimmte Mikrokügelchen-Träger aufeffektive Weise mit proteinartigen Zusammensetzungen verwendet werdenkönnen,um diese Zusammensetzungen einer Stelle der bevorzugten Aktivität zuzuführen, wieauf die topische Oberflächeeiner Pflanze. Kochsalzlösungen,pharmazeutisch annehmbare Puffer und Lösungsmittel und dergleichenkönnenebenfalls als Trägerfür diePeptidzusammensetzungen der Erfindung verwendet werden.

Dieim Wesentlichen aus einem der Peptide der Seq. ID Nrn. 32-47 bestehendenantibiotischen Zusammensetzungen besitzen keine variablen Reste.Diese Zusammensetzungen inhibieren nachweislich das Wachstum vonPilzzellen aus Pilzen, die aus der Gruppe pathogener Pilze, bestehendaus Fusarium-, Rhizoctonia-, Ceratocystis-, Pythium-, Mycosphaerella-und Candida-Spezies ausgewähltsind.

Auf ähnlicheWeise werden zu Vergleichszwecken Verfahren zur Inhibierung desWachstums von Pilzzellen beschrieben, die das Kontaktieren der Pilzzellemit einer antibiotischen Zusammensetzung umfassen, die mindestenseines der Peptide der Seq. ID Nrn. 1-31 umfasst. Unter Anwendungder Techniken der Erfindung sind ausgewählte pathogene Pilze, einigePathogene von Pflanzen und andere Pathogene von Tieren getestetworden. Es ist deswegen speziell gezeigt worden, dass die Verfahrender Erfindung effektiv sind, wenn es sich bei der Pilzzelle um einePilzzelle handelt, die aus der aus Fusarium-, Rhizoctonia-, Ceratocystis-,Pythium-, Mycosphaerella- und Candida-Spezien bestehenden Gruppevon Pilzen ausgewähltwird.

DieVerfahren der Erfindung könnenbei Pilzzellen angewandt werden, bei denen es sich um ein Pathogeneiner Pflanze handelt. In bestimmten bevorzugten Fällen handeltes sich bei dem Teil oder Organ der Pflanze, welches oder welcherbehandelt wird, um einen Samen des anfälligen Pflanzenorganismus.In anderen Fällenwerden die Verfahren der Erfindung bei Pilzzellen eines Pathogenseines Tiers, wie eines Menschen, angewandt.

EinVerfahren zum Auswählenvon antibiotischen Zusammensetzungen wird ebenfalls beschrieben. DasVerfahren umfaßtzuerst das Erzeugen einer kombinatorischen Bibliothek von synthetischenPeptiden, wie hierin beschrieben wird. Als Nächstes, wie hierin ausführlich weiterbeschrieben wird, wird ein Schritt des Kontaktierens einer Reihevon Pilzzellen mit Aliquots der kombinatorischen Bibliothek dersynthetischen Peptide bewerkstelligt, wobei jedes der Aliquots eine äquimolareMischung von Peptiden repräsentiert,bei denen mindestens die zwei C-terminalen Aminosäurerestebekannt sind, und wobei die Reste bei jedem Peptid in der Mischungdie gleichen sind. Nach Verstreichen einer angemessenen Zeitdauerfür dasWachstum wird ein nächsterSchritt durchgeführt,bei dem das Wachstum der Reihe von Pilzzellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellengemessen wird. Zuletzt wird ermittelt, welches der Aliquots dasWachstum der Pilzzellen in der Reihe von Pilzzellen insgesamt amstärkstenreduziert.

Selbstverständlich kanndas gleiche Verfahren ausgeführtwerden, worin jedes der Aliquots eine äquimolare Mischung von Peptidenrepräsentiert,bei denen mindestens drei, vier, fünf oder mehr C-terminale Aminosäurerestebekannt sind (abhängigvon der Gesamtlängedes letztendlichen Peptids in der SPCL). Typischerweise werden solchezunehmend definierten Aliquots sequentiell getestet, um die aufeinanderfolgenden bestenKandidaten-Peptide fürdas Testen auszuwählen.Somit beinhaltet ein zusätzlicherSchritt in dem Verfahren die Anwendung der Bestimmung, welches derAliquots das Gesamtwachstum von Pilzzellen in der Reihe von Pilzzellenreduziert, um auszuwählen,welche Aliquots als nächstesvon einer synthetischen Peptid-kombinatorischen Bibliothek zu testensind, wobei mindestens ein zusätzlicherC-terminaler Aminosäurerestbekannt ist.

EinVerfahren zur Behandlung einer Pilzerkrankung wird ebenfalls offengelegt. Das Verfahren umfaßt zuerstdas Erzeugen einer kombinatorischen Bibliothek von synthetischenPeptiden und das Kontaktieren von Aliquots der kombinatorischenBibliothek der synthetischen Peptide mit einer Zelle eines Pilzes,der fürden ursächlichenWirkstoff der Erkrankung gehalten wird. Als Nächstes wird ein Verfahren zurAuswahl derjenigen Aliquots der kombinatorischen Bibliothek vonsynthetischen Peptiden, die das Wachstum der Pilzzelle am stärksten reduzieren,ausgeführt.Letztendlich wird die Krankheit in einem für die Krankheit anfälligen pflanzlichenOrganismus durch Anwenden des Aliquots der kombinatorischen Bibliothekvon synthetischen Peptiden, welches das Wachstum der Zellen desursächlichenWirkstoffs am stärkstenreduziert, behandelt. Der Behandlungsschritt kann die topische Aufbringungauf den anfälligenOrganismus umfassen, wie Sprühnebel,Nebel, Dämpfe,Pulver und dergleichen im Falle von Pflanzen.

DerFachmann wird erkennen, daß diePeptide der Erfindung, sobald ausgewählt, modifiziert werden können, umfunktionell äquivalenteAminosäuresubstitutionenzu enthalten und dennoch die gleichen oder ähnliche antifungale Eigenschaftenbeizubehalten. Die Bedeutung des Hydropathie-Indexes von Aminosäuren beider Verleihung der biologischen Funktion an ein Protein ist vonKyte und Doolittle (1982) im Allgemeinen erörtert worden. Diese und andereForscher haben herausgefunden, daß bestimmte Aminosäuren für andere Aminosäuren miteinem ähnlichenHydropathie-Index oder -Wert substituiert werden können undtrotzdem eine ähnliche,wenn nicht sogar identische, biologische Aktivität beibehalten wird. Wie inder nachstehenden Tabelle I dargestellt, wird Aminosäuren aufGrundlage ihrer Hydrophobizitätund Ladungsmerkmale ein Hydropathie-Index zugewiesen. Es wird angenommen,daß derrelative hydropathische Charakter der Aminosäure die Sekundärstrukturdes resultierenden Proteins bestimmt, die ihrerseits die Wechselwirkungdes Proteins mit dem Substratmolekül definiert. In ähnlicherWeise bestimmen bei Peptiden, deren Sekundärstruktur kein hauptsächlicherAspekt der Wechselwirkung des Peptides ist, die Position innerhalbdes Peptids und die Charakteristik des Aminosäurerestes die Wechselwirkungen,die das Peptid in einem biologischen System aufweist. Es wird vorgeschlagen,daß einebiologische funktionelle Äquivalenztypischerweise aufrechterhalten werden kann, wenn Aminosäuren miteinem Unterschied von nicht mehr als +/- 1 bis 2 im Indexwert, undbevorzugter mit einem Unterschied innerhalb von +/- 1, ausgetauschtwerden. TABELLE IAMINOSÄUREHYDROPATHIEINDEXIsoleucin4,5Valin4,2Leucin3,8Phenylalanin2,8Cystein/Cystin2,5Methionin1,9Alanin1,8Glycin-0,4Threonin-0,7Tryptophan-0,9Serin-0,8Tyrosin-1,3Prolin-1,6Histidin-3,2Glutaminsäure-3,5Glutamin-3,5Asparaginsäure-3,5Asparagin-3,5Lysin-3,9Arginin-4,5

Sokann zum Beispiel Isoleucin, welches einen Hydropathie-Index von+4,5 aufweist, fürValin (+4,2) oder Leucin (+3,8) substituiert werden, und es wirdimmer noch ein Protein mit ähnlicherbiologischer Aktivität erhalten.Alternativ dazu kann am anderen Ende der Skala Lysin (-3,9) für Arginin(-4,5) substituiert werden, und so weiter.

Folglichbasieren diese Aminosäure-Substitutionenim Allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit von R-Gruppen-Substituenten,zum Beispiel hinsichtlich der Größe, derelektrophilen Eigenschaft, der Ladung und dergleichen. Obwohl diesnicht die einzigen derartigen Substitutionen sind, schließen diebevorzugten Substitutionen, welche verschiedene der vorstehendenCharakteristika in Betracht ziehen, im Allgemeinen die folgendenein: TABELLE IIRestim ursprünglichenScreeningbeispielhafteSubstitutionenAlaningly,serArgininlysAsparagingln,hisAspartatgluCysteinserGlutamataspGlutaminasnGlycinalaHistidinasn,glnIsoleucinleu,valLeucinile,valLysinarg,gln, gluMethioninmet,leu, tyrSerinthrThreoninserTryptophantyrTyrosintrp,pheValinile,leu

HomogenePeptidzusammensetzungen sind hauptsächlich aus einer einzelnenaktiven Peptid-Spezies mit einer wohldefinierten Sequenz aufgebaut.Geringere Mengen (weniger als 20 Mol%) an Verunreinigungen können nebendem Peptid in diesen Zusammensetzungen vorliegen, solange sie diewachstumshemmenden Eigenschaften der aktiven Verbindung nicht stören.

Für die Zweckedieser Erfindung bezieht sich \"aktiverBestandteil\" aufdas Peptid mit der Fähigkeit, dasWachstum von Zielmikroorganismen zu inhibieren. Zielmikroorganismenschließen,ohne darauf beschränktzu sein, diejenigen Pilze ein, die Wurzelverrottung, \"Damping-off\", systemische Infektionen,Gefäßkrankheitenund Infektionen bestimmter Oberflächenbereiche von Pflanzen verursachen.Die Zielmikroorganismen könnenauch Pathogene von Tieren und Menschen einschließen, wie Hefeinfektionen, diebei bestimmten Krankheitszuständendes Menschen häufigsind.

DieseErfindung stellt ferner ein Verfahren zum Inhibieren des mikrobiellenWachstums in Pflanzen mit den Peptidzusammensetzungen der Erfindungbereit. Pilzinfektionen könnenin verschiedenen Stadien der Nutzpflanzenentwicklung verhindertwerden, einschließlich:Schutz von Samen und Samen-Trieben, Aufzucht von Keimlingen undPflanzen, Schutz von geernteten Produkten und Lagerung von Erzeugnissen.Das Verfahren umfaßtdas Beschichten eines Pflanzenteils oder -organs mit der Peptidzusammensetzungder Erfindung in einer Beschichtungsmischung, die einen nicht-störenden Träger undeine wirksame Menge der antimikrobiellen Zusammensetzung umfaßt. Alternativdazu kann die antimikrobielle Zusammensetzung mit einem nicht-störenden flüssigen Träger vermischtund mit Samen, Keimlingen, Pflanzen oder geernteten Produkten kontaktiertwerden oder kann systemisch in Pflanzen eingeführt werden.

KURZBESCHREIBUNG DER BEVORZUGTENAUSFÜHRUNGSFORMENBeispiel I: Synthese einer SPCL

Verfahrenzur Konstruktion von Peptiden mit definierten oder zumindest teilweisedefinierten Sequenzen, wobei die Peptide dann hinsichtlich biologischerAktivitätselektiert werden können,sind bekannt (d. h. U.S.-PatenteNr. 4 833 092, 5 182366, 5 010 175 undGeysen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002). Soweit sie geeignetealternative Verfahren fürdie Synthese solcher Peptide bereitstellen, werden diese Verfahrenspeziell als Bestandteil in dieses Schriftstück aufgenommen. Bei den Techniken,deren Eignung bei der Synthese der Peptidzusammensetzungen der Erfindungim Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt wurde, handeltes sich im Allgemeinen um diejenigen von Houghten et al., Biotechniques4:522-524 (1986) und Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985), wobeibeide genannten Verweisquellen, sofern sie zusätzliche Materialien und Verfahrenbereitstellen, speziell als Bestandteil in dieses Schriftstück aufgenommenwerden.

Fmoc(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-Chemie wurde bei der Herstellung derPeptidbibliotheken angewandt. Diese Vorgehensweise wurde bei allenPeptiden der Erfindung benutzt, ungeachtet dessen, ob sie D- oderL-Analoga umfaßten.Soweit nicht anderweitig angegeben, umfassen die hierin weiter beschriebenen spezifischenPeptide D-Analog-Sequenzen.Die Fmoc-Einheit schütztdie N-alpha-Aminogruppen der Aminosäurederivate und kann durcheine Base, wie Piperidin, entfernt werden, wohingegen die funktionellenSeitenkettengruppen durch säureempfindlicheSchutzgruppen geschütztwerden. Die erste Aminosäurewird an einen säuresensitivenLinker, der an ein Polystyrolharz angeheftet ist, angefügt. NachfolgendeAminosäuren werden über einenZyklus der Fmoc-Entfernung mit 20-25% Piperidin in DMF:NMP (9:1;das NMP wird zugefügt,um bei der Solvatisierung des Harzes zu helfen, was die Fmoc-Entfernung verbessert),6-maliges Waschen des Harzes mit DMF und Zugabe der nächsten Fmoc-geschützten Aminosäure zusammenmit einem passenden Kopplungsmittel, wie PyBOP (Benzotriazol-1-yl-oxy-trix-pyrrolidino-phosphoniumhexafluorphosphat,das nicht-karzinogene Analog von BOP), HBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetra-methyluroniumhexafluorphosphat)oder DCCI (N,N\'-Dicyclohexylcarbodiimid),zusammen mit einer Base, wie N-Methylmorpholin oder Diisopropylethylamin,und HOBT (N-Hydroxylbenzotriazol), welches die Razemisierung während derKopplung verringert, angefügt.Bei kleinen Peptiden ( 10Aminosäuren)ist üblicherweiseein einziger Kopplungsschritt mit einem 3-8-fachen Aminosäureüberschuß, abhängig vonden zur Peptidsynthese verwendeten Gerätschaften, zusammen mit einem ähnlichen Überschuß von jederder vorstehenden Chemikalien, ausreichend.

Beilangen oder komplizierten Peptiden können die vorstehenden Reaktandenentfernt werden, nachdem die Kopplung für eine Dauer von 20 bis 45Minuten abgelaufen ist, zu welchem Zeitpunkt – anstatt das Harz mit DMFzu waschen und das Fmoc fürden nächstenAminosäurezykluszu entfernen – vielmehreine zusätzlicheMenge von Aminosäure,Kopplungsmittel, Base und HOBT zugesetzt wird, um die schrittweise Kopplungseffizienzzu verbessern. Typischerweise ist bei den ersten wenigen Schritteneines durchschnittlichen Peptids eine Kopplungseffizienz von über 99%zu beobachten, währenddie Kopplungseffizienzen mit zunehmender Länge der Peptidketten und Einnahmeeiner signifikanten Tertiärstrukturviel niedriger sein können. Dasdoppelte Koppeln kann die Gesamtausbeute und die Reinheit des Rohproduktessignifikant verbessern. Eine noch weitere Verbesserung wird beobachtet,wenn Peptidketten, bei denen die passende Aminosäure nicht angefügt wird,durch Acetylierung \"gecapped\" bzw. mit einer Kappeversehen werden, was diese Ketten terminiert. Das letztere Verfahrenvermeidet die Synthese von fast-perfekten Peptiden, bei denen möglicherweiseeine einzelne Aminosäurefehlt und die im Fall von langen Peptiden Aufreinigungsproblemewegen der Sequenzähnlichkeitzum gewünschtenPeptid mit voller Längeverursachen könnten.(Die doppelte Kopplung wurde angewandt, um sicherzustellen, daß eine hoheKopplungseffizienz erreicht wurde; es wurde ein 5-facher Überschuß an Aminosäure, PyBOP,und HOBT mit einem 10-fachen Überschuß von NMMverwendet).

DieAufreinigung von Peptidbibliotheken kann auf zwei Wegen durchgeführt werden;für Einzelschritt-Identifikation(einzelne Iterationen) kann eine Reinigung durch HPLC durchgeführt werden,wobei die Peptidmischung in Wasser/0,1% TFA geladen und nach einemkurzen Waschzyklus in Wasser/0,1% TFA mit einem Stufengradientenvon Acetonitril (60% ACN/0,1% TFA) in Wasser/0,1% TFA eluiert wird.Alternativ dazu kann, in den ersten Stufen der Arzneimittelentdeckung,wenn 400 Proben vorliegen können,ein Festphasen-Extraktionsroboter eingesetzt werden, um die Peptidezu eluieren, wobei eine ähnlicheStrategie zu der vorstehend beschriebenen eingesetzt wird. (Es wurdeHPLC-Reinigung aufeiner Vydac C-18-Säuleangewandt, Porengröße 5 m,10 × 250mm).

Beispiel II: Testprotokolle im Allgemeinen

Esgibt Verfahren zur Bestimmung der Toxizität von neuartigen Verbindungengegenüberpotentiellen Zielmikroorganismen. Zum Beispiel kann man das Wachstumvon Reinkulturen eines Testmikroorganismus in einem Mikroplatten-Lesegerät verfolgen.Die Wachstumsraten von Kulturen können auch nach der Zugabe von Testverbindungenzum Wachstumsmedium bestimmt werden. Wenn eine Wachstumsrate nachZugabe einer Testverbindung zum Wachstumsmedium langsamer ist, wirddie Verbindung als antimikrobielles Mittel angesehen; W. F. Broekaertet al., FEMS Microbiology Letters 69, 55 (1990).

DerSchlüsselzur erfolgreichen Identifizierung von Peptiden ist der quantitativeAssay fürdie Messung des mikrobiellen Wachstums gewesen. Peptidsequenzenaus SPCLs, die das Wachstum von im Erdreich befindlichen Pflanzenpathogeneninhibieren, konnten unter Anwendung eines Mikroplatten-Wachstumsassays identifiziertwerden. Kulturvolumina und Sporen- oder Mycelfragment-Inokulumdichtenwurden fürdas Wachstum von Fusarium oxysporum f. lycopersici, Pythium ultimum,Ceratocystis fagacerum, Rhizoctonia solani und Mycosphaerella fijiensisauf Mikroplatten optimiert. Das Trockengewicht dieser Organismenist direkt proportional zu ihrer optischen Dichte in Kultur. SomitkönnenWachstumsraten durch Messen der gestiegenen optischen Dichte einerFlüssigkulturim Verlauf der Zeit bestimmt werden. Wachstumsraten wurden in Anwesenheit undAbwesenheit von zugesetzten Zusammensetzungen, wie SPCLs, bestimmt.Wenn das Wachstum in Anwesenheit dieser Verbindungen inhibiert ist,geht man davon aus, daß dieVerbindungen antimikrobielle Eigenschaften aufweisen. In ähnlicherWeise sind Mikroplatten-Assays mit den Mikroorganismen Erwinia carotovora subp.carotovors und Pseudomonas solanacearum durchgeführt worden.

Praktischjede löslicheVerbindung kann hinsichtlich ihrer Fähigkeit, das Mikrobenwachstumin diesem Assay zu inhibieren, getestet werden, vorzugsweise werdenSPCLs oder Peptide auf diese Weise gescreent. Jeder Mikroorganismus,der in Flüssigkulturgezüchtetwerden kann, kann mit diesem Assay gescreent werden. Obwohl dievorstehend speziell erwähntenMikroorganismen in dieser Erfindung bevorzugt sind, können auchPflanzenpathogene, wie Aspergillus flavus, A. niger, A. terreus,Chaetomium globosum, Monilinia fructicola, Penicilium oxalicum,andere Mycosphaerella spp. untersucht werden. Während des anfänglichenScreenings der Aminosäure-Bibliothek,und wie in den weiteren nachstehenden Beispielen beschrieben, wurden mehrerePeptidmischungen identifiziert, die eine starke wachstumshemmendeAktivitätgegen Zielpathogene aufwiesen.

Wenneine Mischung, wie eine SPCL, antimikrobielle Aktivität aufwies,wurden fürdiese Aktivitätverantwortliche Peptidspezien durch Synthese von Komponenten derMischung und anschließendeerneute Testung identifiziert. Im Anschluß an das anfänglicheScreenen von Peptidmischungen, bei denen die ersten zwei Positionenin der SPCL definiert wurden, wurden diejenigen Mischungen, welchedie höchstewachstumshemmende Aktivitätaufwiesen, einer sukzessiven Reihe von Auswertungen unterworfen.In der nächstenRunde der Auswertung wurden die ersten drei Positionen der hexamerenSequenz synthetisiert. Dann wurde das XXX-Harz in 19 gleiche Portionenaufgeteilt, gefolgt von der Zugabe einer Aminosäure, O3.An dieses Verfahren schloß sichdie Kopplung der zuvor definierten O1 undO2 an. Somit wurden 20 Peptidmischungenhergestellt. In jeder Gruppe waren die ersten drei Reste definiertund die letzten drei Reste waren zufällig. Jede Gruppe wurde dannin dem Bioaktivitätsassay,wie vorstehend beschrieben, getestet. Im Anschluß an diese Vorgehensweise wurdeeine zusätzlicheAminosäureauf jeder Ebene der Auswertung definiert, bis jede Sequenz mit starkenwachstumshemmenden Eigenschaften bestimmt war. Dieses Verfahrenerlaubt die vollständige Definitionvon Sequenzen aus SPCL-Bibliotheken,die als Wachstumsinhibitoren von Zielorganismen nützlich sind.

Mitzunehmender Definition der Positionen kann die Peptidmischung einehöhereWirkstärkeoder eine niedrigere IC50 (Anfangskonzentrationdes Inhibitors füreine 50%ige Inhibition des Wachstums) für die gesamte Reihe von getestetenMikroorganismen aufzeigen, als die vorherige weniger weitgehenddefinierte Mischung. Allerdings ist dies bei der vorliegenden Erfindungkeine strikte Anforderung, weil zwei Peptide synergistische wachstumsinhibierendeEffekte aufweisen könnenund ihre Trennung gereinigte Peptide mit geringerer antimikrobiellerAktivitätergeben kann. Alternativ dazu kann ein Peptid eine synergistischewachstumshemmende Wirkung mit einer anderen Verbindung aufweisen.Da diese sowie derzeitig noch unbekannte Gründe existieren, traf der Erfinderdie Entscheidung, die Selektion von Peptiden nicht nur auf diejenigenzu beschränken,welche zunehmend niedrigere IC50-Werte für jedenTestorganismus in jeder Syntheserunde aufzeigten.

Vielmehrwurden Selektionen vorgenommen, welche im Allgemeinen die niedrigsteIC50 fürdie größte Anzahlvon Testorganismen bereitstellten. Somit unterscheidet sich dieseVorgehensweise von den Mikroorganismus-spezifischen Versuchsansätzen, beidenen die antimikrobielle Aktivität eines Peptidgemisches gegeneine Mikroorganismus-Einzelspeziesmaximiert wird. Aus diesem Grunde, wie in den nachfolgenden Beispielen ersichtlichwird, könntewenn ein zusätzlicherinvarianter Aminosäurerestangefügtwird und die resultierende Peptidmischung erneut bei der gleichenReihe von Testorganismen getestet wird, die IC50 gesenkt seinoder nicht, da sie sich auf eine Mikroorganismus-Einzelspezies bezieht und weil es jadie breitere inhibitorische Aktivität ist, welche anfänglich bevorzugtwird. Sobald eine Kollektion von Peptiden basierend auf dem breiterenSpektrum von Testorganismen erzeugt ist, können selbstverständlich Verfeinerungenhinsichtlich spezieller Zielorganismen vorgenommen werden.

Auchein Pflanzenschutz-Assay kann eingesetzt werden, um die biologischeBekämpfungvon Pilzen, welche \"Damping-off\" und Wurzelverrottungverursachen, auszuwerten. Zusammensetzungen der Erfindung werdenwie hierin beschrieben stabilisiert (Mikroeinkapselung, D-Aminosäuresubstitutionoder terminale End-Kappung usw.) und werden dann in das Erdreichin Kontakt mit der Pflanze, dem Samen, dem Produkt oder dergleicheneingebracht oder zur Beschichtung selbiger verwendet. Die Pflanze,der Samen oder das Produkt wird dann einer Challenge ausgesetzt,wobei diese aus einem Inokulum des die Krankheit verursachendenMikroorganismus besteht Das Inokulum kann in Kontakt mit der Pflanzegebracht werden oder dem Erdreich zugesetzt werden, in dem sichdie Pflanze befindet. Alternativ dazu kann das Inokulum in das Gefäßsystemder Pflanze injiziert werden, insbesondere wenn Gefäßkrankheiten,wie die von Ceratocystis verursachten, zu behandeln sind. Das Pflanzenwachstumwird dann überwacht,um zu ermitteln, ob eine statistisch signifikante Reduktion derSymptome, wie jener, welche beim \"Damping-off\" oder bei der Wurzelverrottung beobachtetwerden, auftritt. Bei einer effektiven Menge der Zusammensetzunghandelt es sich um diejenige Menge, welche zu einer signifikantenReduktion der erkennbaren Pflanzenkrankheitssymptome führt.

Beispiel III: Pilzwachstums-Inhibitions-Assaybei Fusarium, Rhizoctonia, Pythium und Ceratocystis

Heranziehenvon Kulturen. Kulturen von Fusarium oxysporum f. sp. lycopericiRasse 1 (RM-1) [FOLRM-1]; Rhizoctonia solani (Stamm TM-101, Anastomose-Gruppe-1)[RS-101]; Pythiumultimum (Stamm LB1, Baumwolle) [PULB1] und Ceratocystis fagacearum(Stamm BAN 102) [CFBAN102] wurden routinemäßig auf Kartoffel-Dextrose-Agar(PDA)-Schrägplattengehalten. Um Mikrokonidien des Fusarium oxysporum f. sp. lycoperici-Isolateszu erhalten, wurde ein kleiner Teil einer aktiv wachsenden Kulturvon einer PDA-Platte in 50 ml Mineralsalze-Medium überführt, wiebeschrieben von Esposito und Fletcher (Esposito, R. et al., 1961Arch. Biochem. Biophys. 93:369-376). Die Kultur wurde unter Schütteln (125U/min) bei 25°Cinkubiert. Nach 96 Stunden wurde die Pilz-Aufschlämmung, bestehend aus Mycelienund Mikrokonidien, zweimal durch acht Schichten steriles Käse-Tuchgepreßt,wodurch eine Mikrokonidien-Suspension erhalten wird. Die Mikrokonidien-Suspensionwurde dann mit einem Hämazytometerbzw. einer Blutkörperchenzählkammerkalibriert. Sporen von C. fagacearum wurden durch Züchten derKultur auf PDA-Platten bei 25°Cfür eineDauer von sieben Tagen erhalten. Die Platten wurden dann mit Kartoffel-Dextrose-Nährbrühe (PDB,potato dextrose broth) gewaschen, zweimal durch acht Lagen sterilesKäse-Tuchabgeseiht, und die Suspension wurde mit einem Hämazytometer kalibriert. Mikrokonidienvon Fusarium und Sporen von Ceratocystis wurden auf 1-5 × 107/ml eingestellt und in einer 50%igen Glycerinlösung bei-80°C biszur Verwendung aufbewahrt. Um Mycelien-Fragmente von Rhizoctoniazu erhalten, wurde ein einzelnes Sclerotium in 50 ml PDB inokuliertund 5 Tage lang bei 25°Cunter Schütteln(125 U/min) inkubiert. Das wachsende Mycel wurde unter Verwendungeines Gewebe-Homogenisators mit einem Abstand von 0,15 mm zwischendem Rohr und dem Kolben fragmentiert. Dies auf Eis durchgeführt, umjedwede Erwärmungder Probe zu verhindern. Die Mycelfragment-Suspension wurde miteinem Hämazytometerkalibriert. Um Pythium-Oosporen zu erhalten, wurden 25 ml V-8-Cholesterin-Nährbrühe, welchein eine Petrischale gegeben worden waren, mit einem PDA-Pfropf desPilzes inokuliert (Ayers, W. A. et al., 1975, Phytopathology 65:1094-1100)und es wurde ruhend inkubiert. Nach 10 Tagen wurde die Mycel-Matteentnommen, zweimal in sterilem Wasser gewaschen und in sterilemWasser unter Verwendung eines Gewebe-Homogenisators, wie vorstehendbeschrieben, mazeriert. Das Homogenat wurde zweimal durch acht LagenKäse-Tuchabgeseiht, und die Oosporen-Suspensionen wurden mit einem Hämazytometer kalibriert.Alle Pilz-Inokula wurden vor ihrer Verwendung auf die Abwesenheitvon kontaminierenden Bakterien getestet.

Wachstumsinhibitionsassay auf Mikroplatten.

Umdie inhibitorischen Effekte der Testpeptidmischungen zu ermitteln,wurde das Wachstum der Pilzisolate in deren Gegenwart bestimmt.Inhibitorische Effekte auf die Pilzisolate wurden bewirkt durchZubereitung einer zweifachen seriellen Verdünnungsreihe einer wäßrigen Suspensionder Peptidmischungen in PDB in einem Endvolumen von 50 ml in einersterilen Flachbodenmikroplatte mit 96 Vertiefungen (wells). Anschließend wurdein jede Vertiefung das Pilzinokulum in PDB gegeben. Fünfzig Mikrolitereiner 6-8 × 104 Fusarium-Mikrokonidien/ml enthaltendenSuspension wurden dem Peptidgemisch oder dem individuellen Peptidzugesetzt, um eine Endkonzentration von 3-4 × 103 Mikrokonidien/Vertiefungzu erhalten. Mycel-Fragmente von Rhizoctonia wurden auf 6 × 104/ml eingestellt, und 50 ml der Suspensionwurden zu der Peptid-Verdünnungsreihezugesetzt. Pythium-Oosporen wurden auf 1 × 105/mleingestellt, und 50 ml der Suspension wurden zu der Peptid-Verdünnungsreihezugesetzt. FünfzigMikroliter einer 6-8 × 104 Ceratocystis-Sporen/ml enthaltenden Suspensionwurden dem Peptidgemisch oder dem individuellen Peptid zugesetzt,um ein Endvolumen von 100 ml/Vertiefung und 3-4 × 103 Sporen/Vertiefungzu erhalten. Mycosphaerella fijiensis-Sporen wurden in Soytone-Dextrosebei pH 6,7 herangezüchtet.Allerdings kann ein besseres Wachstum in pH-Bereichen von 5,0-5,5erzielt werden.

DieEndkonzentration des Peptidgemisches pro Vertiefung in der zweifach-seriellenVerdünnungsreihebelief sich auf 2500-1,25 mg/ml oder 1250-0,625 mg/ml, abhängig vonder Anfangskonzentration der zu testenden Mischung. Alle Plattenwurden ruhend bei 25°Cinkubiert. Jede Platte beinhaltete drei Vertiefungen, die als Leerprobengeführtwurden, und 9 Vertiefungen, welche das Wachstum der Pilzisolatein Abwesenheit jedweden Peptids überwachten.Vor dem Ablesen wurden die Platten sanft geschüttelt, um jegliches sedimentierteWachstum zu suspendieren. Ablesungen wurden 0, 24, 48 und 70 Stundennach der Inokulation vorgenommen. Das Wachstum wurde überwachtdurch Erhalten von Ablesungen der optischen Dichte (OD) bei 595nm unter Verwendung eines Emax-Präzisions-Mikroplatten-Lesegerätes (MolecularDevices Corp., Menlo Park, CA), welches an einen Think-Jet-Druckervon Hewlett-Packard angeschlossen war. Die IC50 (diezur Inhibierung des Wachstums um 50% notwendige Konzentration) für die Peptide wurdenbasierend auf einer linearen Regressionsanalyse von Wachstumsdatenberechnet. Die zur Berechnung der IC50 für jede Mischungverwendeten Daten entsprechen einer Einzelablesung bei jeder Konzentrationfür jedesPeptidgemisch aufgrund der geringen Probenmenge, die für das Testenzur Verfügungsteht. Analysen wurden in zweifacher oder dreifacher Ausfertigungdurchgeführt.

Beispiel IV: Peptid-induzierte Wachstumsinhibitionvon Ceratocystis, Rhizoctonia, Fusarium und Pythium

Eswurden drei Testrunden durchgeführt,wobei sukzessiv definierte Peptidmischungen verwendet wurden, dieaus der vorstehend beschriebenen SPCL (eine D-Bibliothek) abgeleitetwaren. Unter Anwendung der vorstehend angegebenen Kulturtechnikenwurden Zellen der pathogenen Pilze Ceratocystis fagacerum, Rhizoctoniasolani, Fusarium oxysporum und Pythium ultimum gegen die Reihe vonPeptiden wie beschrieben getestet.

Diein jedem Fall berechnete IC50 (mg/ml) istdie Konzentration der Testpeptidzusammensetzung, die das Wachstumauf 50% des Wertes inhibiert, der ohne Zugabe von Peptid zum Wachstumsmediumerhalten wird. Die Berechnungen der IC50 basiertenauf einer linearen Regressionsanalyse der Daten. In bestimmten Fällen wurdenC50-Werte gesammelt und als unabhängige Dreifachwerteunter Anwendung von drei getrennten Bestimmungen berichtet.

DieDaten fürjedes der vier Pilz-Pathogene sind nachstehend tabellarisch aufgeführt. Injeder Tabelle werden sukzessiv definierte Aliquots der SPCL getestet.In manchen Fällenwar die zuerst getestete Peptid-Reihe diejenige, welche im Allgemeinendefiniert war als O1O2XXXX.In anderen Fällenhandelte es sich bei der ersten getesteten Reihe um O1O2O3XXX (Ceratocystis).In jedem Fall wird die nächsteRunde von getesteten Peptiden durch einen zusätzlichen festgelegten Restdefiniert. Die Seq. ID Nr. ist fürjede getestete Peptidzusammensetzung dargestellt.

Beider schattierten Peptidzusammensetzung handelt es sich in jedemFall um die Peptidzusammensetzung, die verwendet wird, um die SPCL-Fraktionder nächstenRunde zu definieren, welche getestet wurde. Unter Bezugnahme aufdie Tabelle IV kann man nun sehen, daß FRXXXX (Seq. ID Nr. 1) einesignifikante inhibitorische Konzentration von 557 mg/ml bereitstellt,als gegen Rhizoctonia solani getestet wurde. Somit wurden Peptidemit dem FRXXXX in der zweiten Runde getestet. In der zweiten Rundeist ersichtlich, daß Peptide mitder allgemeinen Formel FRLXXX (Seq. ID Nr. 9) eine signifikanteinhibitorische Aktivitätvon 42, 119 und 94 mg/ml in drei separaten Experimenten aufwiesen.Auf Grundlage der Hinweise, daß FRLXXX(Seq. ID Nr. 9)-Peptide von besonderem Interesse waren, wurde anschließend eineVielfalt solcher Peptide getestet und es wurde gezeigt, daß eine derartigePeptidzusammensetzung, FRLKXX (Seq. ID Nr. 14), in drei getrennten Ansätzen einebevorzugte Aktivitätgegen Rhizoctonia aufweist. ÄhnlicheAnalysen wurden in jeder der vier getrennten getesteten Pilzgruppenangewandt.

Auseinem Vergleich der Tabellen (III-VI), welche die vier getestetenPilze zusammenfassen, geht auch hervor, daß es möglich war, die Verfahren derErfindung anzuwenden, um Peptidzusammensetzungen mit einem breitenSpektrum von antifungalen Eigenschaften zu selektieren. In jederTabelle und fürjede nachfolgende Testrunde werden die Peptidzusammensetzungen vonoben nach unten in der Reihenfolge zunehmende IC50-Werte angeordnet.Die obersten Peptidzusammensetzungen in jeder Spalte waren nachweislich dieam stärksteninhibitorischen (niedrigste IC50) für jedenausgewähltenPilz. Weiterhin ist ersichtlich, daß in nachfolgenden getestetenReihen von Peptiden alternative Peptidzusammensetzungen adäquat inhibitorische Ergebnisseergaben. Diese sind durch schattierte Felder in jeder Tabelle angezeigt.Man sollte berücksichtigen,daß nichtalle getesteten Peptidzusammensetzungen in den nachstehenden Tabellenwiedergegeben sind. Lediglich diejenigen, welche signifikante IC50-Werte zeigten, sind tabellarisch aufgeführt. Zusätzliche Testswurden verwendet, um die vollständigeSequenz der einzelnen antibiotischen Peptidzusammensetzungen aufzuklären. DiesePeptide sind in den nachfolgenden Tabellen VII-XII dargestellt. Tabelle III (Ceratocystis fagacerum) (zumVergleich)PeptidIC50PeptidIC50FRIXX
IDNr. 1043,16,18FRLFXX
IDNr. 1826,16,17FRWXXX
IDNr. 1242,18,19FRLHXX
IDNr. 1641,21,20FRLXXX
IDNr. 940,20,21FRLKXX
IDNr. 1447,18,17FRFXXX
IDNr. 1148,16,20FRLRXX
IDNr. 1548,32,14FRMXXX
IDNr. 1362,32,37FRLIXX
IDNr. 2049,23,23FRLLXX
IDNr. 2172,21,16FRLTXX
IDNr. 1778,41,41FRLSXX
IDNr. 1978,62,66FRLAXX
IDNr. 22103,75,72Tabelle IV (Rhizoctonia solani) (zum VergleichPeptidIC50PeptidIC50PeptidIC50FRXXXX
IDNr. 1557FRLXXX
IDNr. 942,119,94FRLKXX
IDNr. 14218,65,79HFXXXX
IDNr. 2557FRIXXX
IDNr. 10203,97,91FRLRXX
IDNr. 15230,152,124FKXXXX
IDNr. 3590FRFXXX
IDNr. 11252,80,68FRLHXX
IDNr. 16273,167,152RQXXXX
IDNr. 4893FRWXXX
IDNr. 12402,148,162FRLTXX
IDNr. 17325,165,156MRXXXX
IDNr. 5969FRMXXX
IDNr. 13362,287,229FRLFXX
IDNr. 18308,131,214MHXXXX
IDNr. 6994FRLSXX
IDNr. 19319,284,134LKXXXX
IDNr. 71099FRLIXX
IDNr. 20329,340,341LRXXXX
IDNr. 81120FRLLXX
IDNr. 21379,320,320FRLAXX
IDNr. 22762,371,361Tabelle V (Fusarium oxysporum) (zum Vergleich)PeptidIC50PeptidIC50PeptidIC50HFXXXX
IDNr. 2309FRIXXX
IDNr. 10173,83,78FRLHXX
IDNr. 16136,144,126MRXXXX
IDNr. 5487FRLXXX
IDNr. 9311,148,151FRLFXX
IDNr. 18305,170,112MHXXXX
IDNr. 6531FRFXXX
EDNr. 11327,160,142FRLLXX
IDNr. 21226,247,142FKXXXX
IDNr. 3597FRMXXX
IDNr. 13356,204,224FRLKXX
IDNr. 14276,245,230LRXXXX
IDNr. 8724FRWXXX
IDNr. 12570,600,479FRLRXX
IDNr. 15287,246,246FRXXXX
IDNr. 1875FRLIXX
IDNr. 20296,301,283RQXXXX
EDNr. 4992FRLTXX
IDNr. 17333,319,283LKXXXX
IDNr. 71086FRLSXX
IDNr. 19726,503,484FRLAXX
IDNr. 221472,792,838Tabelle VI (Pythium ultimum) (zum Vergleich)PeptidIC50PeptidIC50PeptidIC50RQXXXX
IDNr. 4132FRFXXX
IDNr. 1185,100,91FRLLXX
IDNr. 2126,37,34LRXXXX
IDNr. 8347FRLXXX
IDNr. 9138,163,162FRLFXX
IDNr. 18101,48,50MHXXXX
IDNr. 6414FRIXXX
IDNr. 10193,125,157FRLTXX
IDNr. 1754,92,94MRXXXX
IDNr. 5440FRWXXX
IDNr. 12273,240,323FRLHXX
IDNr. 1650,101,92FRXXXX
IDNr. 1492FRMXXX
IDNr. 13326,407,326FRLKXX
IDNr. 1473,88,89FKXXXX
IDNr. 3505FRLRXX
IDNr. 1594,175,184LKXXXX
IDNr. 8530FRLAXX
IDNr. 22295,283,323HFXXXX
IDNr. 2679FRLSXX
IDNr. 19312,287,320FRLIXX
IDNr. 20275,322,323

Beispiel V: Peptid-induzierte Wachstumsinhibitionvon Pilzen unter Verwendung vollständig definierter Peptide

Vollständig definiertePeptidzusammensetzungen wurden ebenfalls gegen die Reihe von Pilzengetestet. Es wurde ein ähnlicherAnsatz wie im vorstehenden Beispiel IV beschrieben herangezogen.Bei den Peptidzusammensetzungen handelte es sich entweder um Tri-,Tetra- oder Pentapeptide, die auf Basis der Screenings zu Beginn,die im vorstehenden Beispiel IV durchgeführt wurden, ausgewählt undzu Vergleichszwecken probiert wurden.

Wiederumwurde lineare Regressionsanalyse angewandt, um die tabellarischaufgeführtenDaten zu erzeugen. Fürdas Tripeptid-Testen basieren die wiedergegebenen Daten auf 72 h-Ablesungenfür jedenPilz, außerPythium. Die Daten fürPythium wurden nach 48 Stunden gesammelt. Bei den Tetrapeptid-Datenwurden alle außerden Ceratocystis-Datennach 94 Stunden gesammelt. Bei den Pentapeptid-Daten wurden alleDaten nach 72 Stunden gesammelt. In jeder der Tabellen VII-IX bedeutet \"cc\" den Korrelationskoeffizienten,und \"n\" ist die Anzahl vonin die Berechnung einfließendenDatenpunkte. Wo ein D- oder ein L-Analog gegen das andere getestetwird, geht die Bezeichnung \"D-\" oder \"L-\" der Peptidsequenzvoraus.

ImFalle des Testens der Pentapeptide kann unter Bezugnahme auf dieTabelle IX ersehen werden, daß sowohlD- als auch L-Isomere getestet wurden. Bei den meisten der getestetenPilze waren Peptidzusammensetzungen, welche aus D-Aminosäuren aufgebautwaren, bei wesentlich niedrigeren Konzentrationen inhibitorisch,als das L-Aminosäurenanalog.Es wurde jedoch überraschenderweisefestgestellt, daß ingewissen Fällen(Ceratocystis) die D- und L-Analoge sich in ihrer inhibitorischerAktivitätim Wesentlichen ähnlichwaren. Tabelle VII (Tripeptide) (zum Vergleich)PeptidFusariumRhizoctoniaCeratocystisPythiumFRF
IDNr. 254162
cc= 0,81
n = 5816
cc= 0,91
n = 61499
cc= 0,98
n = 41921
cc= 0,91
n = 5FRL
IDNr. 267329
cc= 0,97
n = 41951
cc= 0,88
n = 61250
cc= 0,96
n = 42227
cc= 0,99
n = 2FRH
IDNr. 2817733
cc = 0,91
n = 43949
cc= 0,94
n = 41508
cc= 0,93
n = 42164
cc= 0,99
n = 3Tabelle VIII (Tetrapeptide) (zum Vergleich)PeptidFusariumRhizoctoniaCeratocystisPythiumFRLF
IDNr. 29365
cc= 0,88
n = 4327
cc= 0,79
n = 370
cc= 0,87
n = 455
cc= 0,945
n = 3FRLW
IDNr. 30751
cc= 0,90
n = 10328
cc= 0,74
n = 3154
cc= 0,86
n = 4245
cc= 0,95
n = 3Tabelle IX (Pentapeptide) (zum Vergleich)PeptidFusariumRhizoctoniaCeratocystisPythiumD-FRLHF
IDNr. 3131
s.d.= 029
s.d.= 06,7
s.d.= 1,531
s.d.= 4L-FRLHF
IDNr. 31557
s.d.= 12137
s.d.= 2312
s.d.= 1239
s.d.= 39Tabelle X (Hexapeptide)Ceratocystis fagacerumCeratocystis ulmiRhizoctoniasolaniFusarium oxysporumPythiumultimumPeptidIC50IC50IC50IC50IC50FRLKFF
IDNr. 323,0
s.d.= 1FRLKFH
IDNr. 343,09,8
s.d.= 0,412
s.d.= 21124
s.d.= 6FRLKFI
IDNr. 353,0
s.d.= 0,115
s.d.= 549
s.d.= 8FRLKFK
IDNr. 363,0
s.d.= 118
s.d.= 213
s.d.= 111
s.d.= 3FRLKFL
IDNr. 373,0
s.d.= 115
s.d.= 124
s.d.= 6FRLKFY
IDNr. 383.09
s.d.= 12014
s.d.= 1FRLKFV
IDNr. 335,0
s.d.= 112
s.d.= 121
s.d.= 110
s.d.= 1FRLKFQ
IDNr. 4622
s.d.= 1FRLKFR
IDNr. 4215
s.d.= 117
s.d.= 1FRLKFM
IDNr. 4423
s.d.= 7FRLKFT
IDNr. 4521
s.d.= 121
s.d.= 5FRLKFS
IDNr. 4319
s.d.= 214
s.d.= 1FRLKFW
IDNr. 4721
s.d.= 1L-HFKLRF
IDNr. 4111,9
s.d.= 1,772
s.d.= 18Tabelle XI (Heptapeptide)CeratocystisfagacerumCeratocystisulmiRhizoctoniasolaniPeptidIC50IC50IC50FRLKFHF
IDNr. 3911,9
s.d.= 0,65,127
s.d.= 4FRLKFHI
IDNr. 408,2
s.d.= 0,54,1
s.d.= 0,120
s.d.= 1

Beispiel VI: Wachstum und Assay für Mycosphaerella

EineKultur von Mycosphaerella fijiensis var. difformis ATCC 36054 wurderoutinemäßig aufSoytone-Dextrose-Agarkeilen gehalten. Um Mycelfragmente von Mycosphaerellazu erhalten, wurde ein Teil des Mycel-Wachstums von einem Keil in50 ml Soytone-Dextrose-Nährlösung (SDB)[mit Essigsäureauf pH 5,0 eingestellt] inokuliert und 6 Tage lang unter Schütteln (125U/min) bei 28°Cinkubiert.

DasMycelwachstum wurde unter Verwendung eines Gewebe-Homogenisatorsmit einem Spalt von 0,15 mm zwischen dem Rohr und dem Kolben fragmentiert.Das Verfahren wurde auf Eis durchgeführt, um jegliche Erwärmung derProbe zu verhindern. Die Mycelfragment-Suspension wurde mit einemHämazytometerkalibriert. Mycelfragmente von Mycosphaerella wurden auf 1 × 106 mg/ml in 1 × SDB eingestellt.

AllePlatten wurden ruhend bei 28°Cinkubiert. Jede Platte beinhaltete drei Vertiefungen ein, die als Leerprobengeführtwurden, und 9 Vertiefungen, welche das Wachstum des Pilzes in Abwesenheitvon irgendeinem Peptid überwachten.Vor der Ablesung wurden die Platten sanft geschüttelt, um jedwedes sedimentierteWachstum zu suspendieren.

Ablesungenwurden 0, 24, 48, 72, 96, 120 und 144 Stunden nach der Inokulierungvorgenommen. Das Wachstum wurde durch Erhalten von Ablesungen deroptischen Dichte (OD) bei 595 nm unter Verwendung eines Emax-Präzisions-Mikroplattenlesegerätes (MolecularDevices Corp., Menlo Park, CA) erhalten, welches an einen Think-Jet-Drucker vonHewlett-Packart angeschlossen war. Die IC50-Berechnungenbasierten auf der linearen Regressionsanalyse von Wachstumsdaten.Zur Berechnung der IC50 für jede Mischungverwendete Daten repräsentierteneine dreifache Ablesung bei jeder Konzentration für jede Peptidmischung.

Mycosphaerellafijiensis var difformis ATCC 36054-Kulturen wurden in Anwesenheitoder Abwesenheit des D-Aminosäure-Peptidanalogsvon FRLHF (Seq. ID Nr. 31) in Soytone-Dextrose bei pH 6,7 (pH-Bereiche 5,0-5,5fördernbesseres Wachstum) gezüchtet.Eine berechnete IC50 (mg/ml) des PeptidesD-FRLHF (Seq. ID Nr. 31) von 10,5 ± 2,60 wurde als der Mittelwertvon drei Wiederholungs-Auswertungen erhalten. Die Werte basiertenauf 141-Stunden-Ablesungen des Wachstums im Vergleich zu Kontrollenohne zugesetztes Peptid. Ein berechneter IC50-Wertvon 57 + 0,0 wurde als Mittelwert von drei Wiederholungs-Auswertungenfür das PeptidL-FRLHF (Seq. ID Nr. 31) erhalten.

Beispiel VII: Wachstum und Assay für Candida

DerCandida albicans-Stamm BG1 wurde auf tryptischem Soja-Agar (Difco)bei 25°Cherangezüchtet, umChlamydosporen zu erhalten. Eine Suspension des Wachstums wurdemit tryptischem Soja-Nährmedium (TSB)angefertigt und auf eine optische Dichte von 0,10 bei 600 nm eingestellt.Die Chlamydosporen-Zahl wurde unter Verwendung eines Hämazytometersbestimmt. Das Peptid oder die Peptidmischung wurde seriell verdünnt, wievorstehend beschrieben, außerdaß TSBanstelle von PDB verwendet wurde. Fünfzig Mikroliter der Chlamydosporen-Suspensionwurden zu der Peptidsuspension zugesetzt, um eine letztendlicheChlamydosporen-Konzentration von 1 × 106 proVertiefung zu erhalten. Die Endkonzentration des Peptids oder derPeptidmischung pro Vertiefung in der zweifach-seriellen Verdünnungsreihe in einem Endvolumenvon 50 ml, in einer sterilen 96-Vertiefungs-Flachboden-Mikroplatte,belief sich auf 2500-1,255 mg/ml oder 1250-0,625 mg/ml, in Abhängigkeitvon der Anfangskonzentration des Peptids oder des Peptidgemischs,das getestet wurde.

DieMikrotiterplatten wurden bei 200 U/min auf einem Rotationsplattform-Schüttler bei37°C inkubiert. JedePlatte beinhaltete drei Vertiefungen, die als Leerproben geführt wurden,und 9 Vertiefungen, welche das Wachstum des Pilzisolats in Abwesenheitvon jedwedem Peptid überwachten.

Vorder Ablesung wurden die Platten sanft geschüttelt, um jegliches sedimentierteWachstum zu suspendieren. Ablesungen wurden bei 0 h und stündlich während 8h danach vorgenommen. Das Wachstum wurde überwacht durch Erhalten vonAblesungen der optischen Dichte (OD) bei 595 nm unter Verwendungeines Emax-Präzisions-Mikroplatten-Lesegerätes (MolecularDevices Corp., Menlo Park, CA), welches an einen Think-Jet-Drucker von Hewlett-Packardangeschlossen war. Die IC50 für Peptidewurden unter Anwendung von linearer Regressionsanalyse von Wachstumsdatenberechnet.

Korrelationzwischen Mycel-Trockengewicht und optischer Dichte. Die Pilzisolatewurden inokuliert, wie vorstehend beschrieben, in Abwesenheit jedwederinhibitorischen Verbindungen. Die OD-Ablesungen wurden über eineZeitperiode von 96 Stunden vorgenommen, wobei dreißig Vertiefungenan jeder der Zeitperioden erfaßtwurden. Die Proben wurden durch Filtration (10/Filter) durch imVorhinein abgewogene Glasfilter (0,45 Mikron) gesammelt. Die Filterwurden bei 70°Cin einem Vakuumofen bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet,und das tarierte Gewicht wurde von dem Proben-Filter-Gewicht subtrahiert,um das Trockengewicht der Mycelmasse zu bestimmen.

Beispiel VIII: Peptid-induzierte Wachstumsinhibitionvon Hefen

ÄhnlicheUntersuchungen wurden an Hefe ausgeführt. Die in der Tabelle XIIberichteten Daten basieren auf logarithmischen Regressionsanalysender Daten. Die Daten basierten auf 6 h-Ablesungen von bei 37°C inkubiertenKulturen.

UnterBezugnahme auf die Tabelle XII kann nun ersehen werden, daß bestimmteder variablen Peptidzusammensetzungen der Erfindung gegen die HefeCandida albicans getestet wurden. Zusätzlich wurden bestimmte vollständig definiertePeptide der Erfindung, die drei und vier Reste umfassen, getestet.Wo ein L-Analog anstelle eines D-Analogs getestet wird, geht dieBezeichnung \"L-\" der Peptidsequenzvoraus. Tabelle XII (Candida albicans) (zum Vergleich)PeptidIC50PeptidIC50FRLXXX
IDNr. 989
cc= 0,99
n = 4FRLHXX
IDNr. 16497
cc= 0,98
n = 5FRIXXX
IDNr. 10106
cc= 0,99
n = 4FRLWXX
IDNr. 23519
cc= 0,92
n = 5FRFXXX
IDNr. 11578
cc= 0,72
n = 8FRLF
IDNr. 29637
cc= 0,99
n = 7FRMXXX
IDNr. 13611
cc= 0,81
n = 6FRLW
IDNr. 30641
cc= 0,99
n = 5FRWXXX
IDNr. 12616
cc= 0,75
n = 6L-FRLF
IDNr. 29946
cc= 0,88
n = 4FRLLXX
IDNr. 2197
cc= 0,97
n = 4FRL
IDNr. 261550
cc= 0,77
n = 4FRLFXX
IDNr. 18108
cc= 0,97
n = 3FRW
IDNr. 271837
cc= 0,99
n = 4FRLIXX
IDNr. 20159
cc= 0,79
n = 3FRH
IDNr. 281889
cc= 0,98
n = 5FRLMXX
IDNr. 24210
cc= 0,99
n = 3FRF
IDNr. 251994
cc= 0,98
n = 6FRLRXX
IDNr. 15409
cc= 0,96
n = 41

Beispiel IX: Obligat parasitische Organismen.

Ingewissen Fällenkann es wünschenswertersein, die Inhibitionsassays direkt an bestimmten anfälligen Wirtsorganismendurchzuführen,falls derartige Mikroorganismen nicht unabhängig vom Wirtsorganismus wachsenkönnenoder wo ein unabhängigesWachstum der Mikroorganismen aus dem Wirt anderweitig problematischist. Zum Beispiel wird der Pulver-Mehltau von Rosen durch den obligatenParasiten Sphaerothecia pannosa f. sp. rosae verursacht. In solchenFällenwird es notwendig sein, die Inhibition des Peptides oder der Peptidmischungan infizierten Wirtspflanzen zu testen.

Beispiel X: Untersuchungen an Schadstellenvon Obst nach der Ernte

Inanderen Fällenkann es erwünschtsein, die Effektivitätder Peptidzusammensetzungen der Erfindung direkt an geernteten Landbauprodukten,wie Obst, zu testen. Janisiewicz et al., 1991 beschreibt einen Nach-Ernte-Testzur Bekämpfungvon Blauschimmel und Grauschimmel auf Äpfeln und Birnen durch Eintauchbehandelnmit Pyrrolnitrin, welches exemplarisch ist; siehe Artikel derselbenAutoren in Plant Disease 75:490-494 (1991). Pathogene von Interessewerden isoliert und konserviert, wie vorstehend beschrieben.

GoldenDelicious-Äpfelwerden geerntet und bei einem Minimal-Spray-Dosierschema gehalten.Das Obst kann bei 1° ± 1°C und 95 ±2% relativerFeuchtigkeit (RH) fürmindestens 2 Monate vor Gebrauch gelagert werden. Die in den Testsverwendeten Früchtewerden hinsichtlich einheitlicher Größe und Reife ausgewählt. In ähnlicherWeise werden Bosc-Birnengeerntet und unter den gleichen Bedingungen gelagert und innerhalb von2 Monaten nach der Ernte verwendet. Die Festigkeit der Äpfel undBirnen wird vor dem Inokulieren mit Pilzen getestet, und sie sollteneine Festigkeit von ungefähr11 (Äpfel)und 14 (Birnen) Pfund Kraft aufweisen, wie bestimmt durch Effegi-Drucktests.

Obstwird durch eines von drei Verfahren verletzt. Schnittwunden werdendurch Einschneiden eines Einschnittes von 3 mm im Quadrat 3 mm tiefmit einem scharfen Instrument und Entfernen des Gewebes erzeugt.Zwei solche Wunden im Abstand von ungefähr 2 cm werden auf jeder Fruchterzeugt. Einstich-Wunden werden mit zwei Nägeln mit einem von Durchmesservon 6,1 mm in einem Abstand von 2 cm und 4 mm aus einem Holzblockherausragend erzeugt. \"Quetsch\"-Verletzungen werdenerzeugt durch Pressen zweier Schraubenköpfe (1 cm Durchmesser) gegendie Fruchtoberflächebis zu einer Tiefe von 2-3 mm, wobei die Haut der Frucht verletztwird. Die Schraubenköpfewerden in einem Abstand von 2 cm auf einem Holzblock montiert sein.Alle Verletzungen werden bei etwa der Hälfte entlang der Linie zwischendem Calyx- und dem Stengel-Ende erzeugt werden.

DieFrüchtewerden in Suspensionen eingetaucht, die den Testorganismus alleinoder gemischt mit verschiedenen Konzentrationen der zu testendenPeptidzusammensetzung enthalten. Verletzte Apfel- oder Birnenfrüchte (zweiVerletzungen pro Frucht) werden 2 Minuten lang unter gelegentlichemBewegen in die Suspensionen eingetaucht. Die Früchte werden dann auf Polystyrol-Obsttragen-Packungenmit der verletzten Flächenach oben in 1-Scheffel-Obstkisten mit Polyethylenauskleidung gelegt.Früchteaus jeder Behandlung werden auf separate Tragen in separaten Kistengelegt. Es werden fünfFrüchtepro Behandlung verwendet, und jede Behandlung wird dreimal wiederholt.Die Kisten werden bei der Lagerung als zufällig verteilte Blöcke plaziert.

EinSatz von so behandelten Früchtenwird 7 Tage lang bei 24°Cund 95 ± 2%RH aufbewahrt, und der andere Satz wird 30 Tage lang bei 2°C aufbewahrt.Die Lagerung bei 24°Cist ausgelegt, um optimale Bedingungen zur Entwicklung der Pilzkrankheitenaufrechtzuerhalten oder herbeizuführen, und die Länge derLagerungsdauern wird gewählt,um es möglichzu machen, Schädenzu messen, bevor die Früchtevollständigverrottet sind. Am Ende der Lagerungsdauer wird der Durchmesservon Schädigungensenkrecht zu der Achse, welche die zwei Verletzungen verbindet,gemessen.

Beispiel XI: Phytotoxizitäts-/Mutagenitäts-Bestimmungen

Phytotoxizitäts-Untersuchungenwerden durch Überwachendes Wachstums von Wasserlinse (Lemna minor) und der Keimung vonReissamen (Oryzae sativa) durchgeführt. Übliche Wasserlinse-Phytotoxizitätstestssind einfach, empfindlich und kostengünstig. Axenische L. minor werdenin Kolben herangezogen, wobei das Medium von Bowker verwendet wird,wie beschrieben von Caux (Caux, P. Y. et al., 1988. Environmental Toxicologyand Chemistry 7:671-676). Eine klonale Population wird durch vegetativeVermehrung eines Inokulums eines einzelnen Wedels erhalten. Dieindividuellen Peptide werden dem Assaymedium zugegeben, und diePflanzen werden im Hinblick auf den Anstieg der Biomasse und Funktionsstörung beider Photosynthese (Caux, P. Y. et al., 1988, Environmental Toxicologyand Chemistry 7:671-676) füreine Dauer von 14 Tagen überwacht.Reis ist eine wirtschaftlich bedeutende Nutzpflanze und wird alsSpezies fürdie Testung der Toxizitätempfohlen (Wang, W. 1991, Environmental Toxicology and Chemistry10:1173-1177). Die Bedingungen fürdas Testen werden diejenigen sein, welche von Wang beschrieben wurden(Wang, W. 1991, Environmental Toxicology and Chemistry 10:1173-1177).Um eine potenzielle Gentoxizitätzu evaluieren, werden die Peptide von Interesse unter Verwendungdes Salmonellen/Mikrosomen-Assays (Maron, D. M., und B. N. Ames.1983, Mutat. Res.: 173-215) und des Mikroscreen-Prophagen-Induktions-Assays (Rossman,T. G., et al., 1984, Environ. Mutagen. 6:59-69) ausgewertet. DiehämolytischeAktivitätwird durch das Verfahren von Zasloff (Zasloff, M., 1987, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 84:5449-5453) beurteilt.

Beispiel XII: Stabilisieren der Peptide

EineVielzahl von Modifikationen kann an den Peptiden vorgenommen werden,solange die antimikrobielle Aktivität erhalten bleibt. Einige Modifikationenkönnendazu dienen, die intrinsische antimikrobielle Wirkstärke desPeptids zu erhöhen.Andere Modifikationen könnenden Umgang mit dem Peptid erleichtern. Bei den funktionellen Peptid-Gruppen,die typischerweise modifiziert werden können, handelt es sich u. a.um Hydroxyl, Amino, Guanidinium, Carboxyl, Amid, Phenol, Imidazolringeoder Sulfhydryl ein. Bei den typischen Reaktionen dieser Gruppenhandelt es sich u.a., aber ohne darauf eingeschränkt zu sein, um die Acetylierung vonHydroxylgruppen durch Alkylhalogenide. Carboxylgruppen können verestert,amidiert oder zu Alkoholen reduziert sein. Carbodiimide oder andereKatalysatoren könnenverwendet werden, um die Amidierung von Carboxylgruppen zu katalysieren.Die Amidgruppen von Asparagin oder Glutamin können unter sauren oder basischenBedingungen deamidiert werden. Acylierungs-, Alkylierungs-, Arylierungs-oder Amidierungsreaktionen mit Aminogruppen, wie der primären Aminogruppedes Peptids oder der Aminogruppe von Lysinresten, laufen leichtab. Die Phenolgruppe von Tyrosin kann halogeniert oder nitriertwerden. Beispiele, bei denen die Löslichkeit eines Peptids verringertwerden konnte, sind u. a. die Acylierung von geladenen Lysinrestenoder die Acetylierung der Carboxylgruppen von Asparagin- und Glutaminsäure ein.Peptide könnenan löslicheoder unlöslicheTrägermoleküle konjugiertsein, um ihre Löslichkeitseigenschaftennach Bedarf zu modifizieren und die lokalen Konzentrationen vonPeptiden in ihren Zielbereichen zu erhöhen. Die Peptidzusammensetzungen derErfindung könnenauch in das Gefäßsystemeiner Pflanze injiziert werden. Beispiele von löslichen Trägermolekülen sind u. a. Polyethylenglykol- und Polyvinylpyrrolidon-Polymere.Beispiele unlöslicherPolymere sind u. a. Sand oder andere Silicate oder Polystyrol, Celluloseoder dergleichen. Peptide könnenauch mikroeingekapselt werden, um ihre Stabilität während der Anwendung auf Saatgut,das Erdreich oder die Pflanze zu verbessern. Typischerweise werdenPolyester-Mikrokügelchenverwendet, um die Peptide einzukapseln und zu stabilisieren.

Beispiel XIII: Peptidsynthese im großen Maßstab

EinePeptidsynthese im großenMaßstab(bis zu 60 kg) in Lösungoder auf Festphase wird durchgeführtwerden, sobald besondere Peptidzusammensetzungen zur Verwendungin großerMenge ausgewählt sind.Diese Synthese erfordert eine sorgfältige Auswahl von Schutzgruppenund Kondensationsverfahren. Alle Ausgangsmaterialien und Reagenzienkönnenin guter Reinheit von Chemikalienherstellern, wie Sigma ChemicalCo. oder Aldrich Chemical Co, bezogen werden. Die Razemisierungvon Aminosäure-Bausteinenunter Kopplungsbedingungen kann durch Verwendung von Reagenziender neuen Generation, d.h. HOBt, HOAt, HBTU oder HATU, stark unterdrückt odergänzlicheliminiert werden. Sogar die Festphasen-Methodik ist derzeitig geeignetentwickelt, um pharmazeutische Peptide in mehrfachen Mengen von1 bis 10 kg/Jahr herzustellen.

Synthesevon Peptiden in Lösungin großemMaßstab.Die Lösungsphasen-Syntheseermöglichteine einfache Planung hinsichtlich der Gruppenschutz-Strategie,Fragmentauswahl und Verfahren der Fragmentkopplung, um die Razemisierungzu minimieren. Die Zwischenstufen können gelegentlich einfach durch Kristallisationstechnikenisoliert werden, was die Notwendigkeit für eine Aufreinigung durch Säulenchromatographieeliminieren kann und deshalb das Maßstabsvergrößerungspotential verbessernkann. Die Qualitätgleichzeitig hergestellter Fragmente kann bei jeder Stufe ohne Weitereskontrolliert werden.

Festphasen-Synthesevon Peptiden in großemMaßstab.Die Kosten der fortschrittlicheren Polymere für die Festphasen-Synthese sindfür gewöhnlich hoch.Zum Teil sind diese Trägernicht als Massenware erhältlich.Jedoch spielen ihre Eigenschaften eine wichtige Rolle bei der Zugänglichkeitdes verankerten Peptids und der Freisetzung des Peptids von demHarz in einer vollständiggeschützten,entschütztenoder modifizierten Form. Der Übergangvom Laboratoriums- zum Produktionsmaßstab bei der Festphasen-Peptidsynthese (SPPS,solid-phase peptide synthesis) bietet einen deutlichen Vorteil,weil das gesamte Syntheseverfahren leicht automatisiert werden könnte, unddie Effizienz der Syntheseschritte überwacht und optimiert werden könnte. DieAktivierungsprozesse im Produktionsmaßstab sind gut bekannt undungefährlichfür dieUmwelt. Darüberhinaus ermöglichtSPPS eine direkte Rückgewinnungund Zurückführung von überschüssigen Aminosäure-Bausteinenaus den Abfallfiltraten beim Produktionsmaßstab.

Diefolgenden Literaturstellen werden durch Bezugnahme zu einem Bestandteildes vorliegenden Schriftstücksgemacht:
Boris Group, \"Productionof large-scale peptides in solution.\" Biochem. Soc. Trans., 18(6), 1299-306;Christian Birr, \"Thetransition to solid-phase production of pharmaceutical peptides,\" Biochem. Soc. Trans.,18(6), 1313-16 und Paul Lloyd-Williams, Fernando Albericio und ErnestGiralt, \"Convergentsolid-phase peptide synthesis\".Tetrahedron 49(48), 11065-11133. Sofern Synthesen der Peptidzusammensetzungender Erfindung in großemMaßstabbewerkstelligt werden sollen, sollte man sich an die Verfahren undMaterialien halten, welche in diesen Referenzen aufgeführt sind.

Wennfestgestellt wurde, daß einL-Aminosäure-Peptidausreichend inhibitorisch (entweder mit oder ohne Stabilisierung)ist, kann es selbstverständlichmöglichsein, rekombinante DNA-Expression gemäß den Techniken, welche demFachmann gut bekannt sind, zur Herstellung solcher Peptide in Mengenvon großem Maßstab anzuwenden.Sofern rekombinante Peptide hergestellt werden sollen und soferndie Stabilitätsolcher Peptide gewünschtist, kann das Peptid vor einem Angriff an jedem Terminus durch kovalentesVerknüpfenvon D-Aminosäurenan einem oder dem anderen oder an beiden Termini geschützt werden,wobei Techniken angewandt werden, welche dem Fachmann auf dem Gebietder Peptidchemie bekannt sind.

Beispiel XVI: Samen-Behandlung

EinVerfahren zum Schutz von Samen wird ebenfalls offenbart. Das Verfahrenzur Beschichtung von Samen mit einer antimikrobiellen Verbindungist dem Fachmann gut bekannt. Jegliches herkömmliche Verfahren, welchesden Wirkstoff nicht zerstört,ist fürdie Zwecke dieser Erfindung angemessen. Ein einfaches und bevorzugtesVerfahren besteht darin, den Wirkstoff in 1,0-1,5%iger wäßriger Methylcellulosezu suspendieren oder zu lösen.Der zu schützendeSamen wird in die Suspension gegeben und gründlich damit vermischt, um dieOberflächedes Samens mit der Suspension zu beschichten. Dann wird der Samenluftgetrocknet. Der Samen ist vor Pilzinfektionen bei der Keimunggeschützt,weil das Überzugsmaterialden Wirkstoff in die unmittelbare Nachbarschaft des Samens bringt.

EffektiveKonzentrationen des Wirkstoffs werden bestimmt durch Einmischenverschiedener Mengen des Wirkstoffs in die flüssige Beschichtungsmischungund Beschichten von Samen-Chargen. Die Samen werden dann in denErdboden eingepflanzt und einer Challenge durch Krankheitsmikroorganismenausgesetzt. Die Auskeimungsrate der Samen wird bestimmt und eineMindestkonzentration des Wirkstoffs wird bestimmt, bei der statistischverbesserte Auskeimungsraten erhalten werden. Die Keimlingsüberlebens-und allgemeinen Pflanzenüberlebens-Ratenkönnenebenfalls bestimmt werden. HöhereKonzentrationen des antimikrobiellen Mittels können verwendet werden, sofernsie nachweislich das Überlebendes Keimlings oder der Pflanze erhöhen oder den Pflanzenertragsteigern.

WeitereVerfahren zur Bekämpfungvon landwirtschaftlichen Pilzinfektionen können eingesetzt werden. Mikroorganismenkönnendirekt mit einer wirksamen Menge einer Wirkstoff-Zusammensetzungdieser Erfindung, typischerweise in dem passenden Träger gelöst, kontaktiertwerden. Beispiele von angemessenen Trägern sind im Fachgebiet bekanntund könnenPhosphatpuffer oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung beiphysiologischem pH-Wert umfassen.

EineSamenbehandlung mittels Aufbringen von Materialien, und zwar entwederchemischen, biologischen oder einer Kombination, auf den Samen alsSchutz vor einem Angriff durch im Erdreich befindliche Pathogeneund Insekten kann typischerweise unter Anwendung zweier gebräuchlicherAufbringungsverfahren bewerkstelligt werden. (1)Kommerzielles Beschichten durch Saatgut-Gesellschaften. KommerzielleBehandler werden normalerweise eine Aufschlämmung des Peptidmaterials inWasser herstellen und die Aufschlämmung in Form eines Sprühnebelsauf das Saatgut aufbringen. Die Samen werden dann getrocknet undzum Verkauf abgepackt.(2) Ein Dünger-bzw. Trichterkasten-Verfahren kann ebenfalls verwendet werden. DasPeptidmaterial wird vom Bauern vor dem Einpflanzen aufgebracht.Das Material wird als ein trockenes Pulver über der Oberseite des Trichterkastensverteilt. Typischerweise wird die Hälfte des Saatguts, die Hälfte desFungizids, dann der Rest des Saatguts und schließlich der Rest des Fungizidsin den Trichterkasten gegeben.

ZITIERTE LITERATURSTELLEN

Diefolgenden Literaturstellen werden speziell zu einem Bestandteildieses Schriftstücksgemacht, sofern sie ergänzendeEinzelheiten zu den hierin dargelegten Verfahren bereitstellen. Caux, P. Y., P. Weinberger und D. B. Carlisle. 1988. A physiologicalstudy of the effects of triton surfactants on Lemna minor L. EnvironmentalToxicology and Chemistry 7:671-676.Cull, MV. G., J. F. Miller und P. J. Schatz. 1992. Screeningfor receptor ligands using large libraries of peptides linked tothe C terminus of the lac repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:1865-1869.Fiedler, H. P., R. Kurth, J. Langharig, J. Delzer und H. Zahner.1982. Nikomycins: microbial inhibitors of chitin synthase. J. Chem.Technol. Biotechnol. 32:271-280.Furka, A., F. Sebastyen, M. Asgedom und G. Dibo. 1991. Generalmethod for rapid synthesis of multicomponent peptide mixtures. Int.J. Pept. Protein Res. 37:487-493.Gramsch, C, T. Meo, G. Riethmuller und A. Herz. 1983. Bindingcharacteristics of a monoclonal β-endorphin antibodyrecognizing the N-terminus of opioid peptides. J. Neurochem. 40:1220-1226.Houghten, R. A., C. Pinilla, S. E. Blondelle, J. R. Appel, C.T. Dooley und J. H. Cuervo. 1991. Generation and use of syntheticpeptide combinatorial libraries for basic research and drug discovery.Nature 354:84-86.Houghten, R. A., J. R. Appel, S. E. Blondelle, J. H. Cuervo,C. T. Dooley und C. Pinilla. 1992. The use of synthetic peptidecombination libraries for the identification of bioactive peptides.BioTechniques 13:412-421.Houghten, R. A., Blondelle, S. E., Cuervo, J. H., in Innovationsand Perspectives in Solid Phase Synthesis. Canterbury; Epton, R.,Hrsg., Solid Phase Conference Coordination, Ltd.: Canterbury, 1992.Isono, K. und S. Suzuki. 1979. The polyoxins: pyrimidine nucleosidepeptide antibiotics inhibiting fungal cell wall biosynthesis. Heterocycles13:333-351.Lerner, R. A. 1982. tapping the immunological repertoire toproduce antibodies of predetermined specificity. Nature 299:592-596.Maron, D. M., und B. N. Ames. 1983. Revised methods for theSalmonella mutagenicity test. Mutat. Res.: 173-215.Pinilla, C, J. R. Appel und R. A. Houghten. 1992. Syntheticpeptide combinatorial libraries: the screening of tens of millionsof peptides for basic research and drug discovery. in Vaccines 92;Brown, F., Chanock, R. M., Ginsberg, H. S., Lerner, R. A., Hrsg.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992 S.25 ff.Rossman, T. G., M. Molina und L. W. Meyer. 1984. the genetictoxicology of metal compounds. I. Induction of lambda prophage inE. coli WP2, Environ. Mutagen. 6:59-69.Wang, W. 1991. Ammonia toxicity to macrophytes (common duckweedsand rice) using static and renewal methods. Environmental Toxicologyand Chemistry 10:1173-1177.Zasloff, M. 1987. Magainins, a class of antimicrobial peptidesfrom Xenopus skin: Isolation, characterization of two active forms,and partial cDNA sequence of precursor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:5449-5453.

SEQUENZLISTE(1-31 fürVergleichszwecke)