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scarabgenomics在pDNA生产中遇到的一个常见挑战是茎环DNA结构的存在，例如病毒长末端重复序列（LTR）或短发夹RNA（shRNA），它们难以复制并且即使在特意设计的E中也使载体不稳定大肠杆菌宿主，例如Stbl3™。清洁Genome® 大肠杆菌可显着提高不稳定pDNA载体的产量。

CleanGenome®E . coli Out表现出用于慢病毒生产的Stbl3™。Chakiath＆Esposito（2007）研究表明，“包含慢重复序列的慢病毒表达克隆通常在大肠杆菌中表现出极大的不稳定性。。” 即使是专门设计用于克隆慢病毒直接重复序列的宿主（例如Stbl3™）也被证明是不足够的。Chakiath＆Esposito表明，CleanGenome® 大肠杆菌菌株MDS™42是基因组平台减少的基础菌株，可稳定包含这些重复序列的慢病毒表达克隆（图1）。在使用MDS™42进行的100多次克隆反应中，这些作者仅选择了两个转化子菌落进行分析，在超过95％的情况下，两个克隆都具有正确的限制性图谱，从而节省了重组质粒制备的大量时间和精力。

同样，衍生自腺相关病毒（AAV）的载体带有两个反向重复序列，形成40 bp茎。在末端，另外两个9bp的茎分支进一步终止于环结构。这两个茎环本身包含直接重复序列，当在标准大肠杆菌宿主中生长时，特别容易被删除。极端的例子是pT-ITR-IL2载体（图2），其中包含ITR1和ITR2茎环，它们也是彼此直接重复的。

为了测试CleanGenome®菌株解决不稳定的生物治疗性pDNA生产挑战的能力，圣甲虫基因组公司使用了腺相关病毒pT-ITR-IL2载体。将其转化到MDS™42和未还原的亲本菌株大肠杆菌中K-12 MG1655。选择含有对NotI，KpnI和MscI具有正确限制模式的质粒的克隆。

为了测试在大肠杆菌中的生长过程中的稳定性，将来自两个宿主的一式三份的克隆在Luria Broth中在37°C下生长24小时，并进行选择。取出培养样品进行分析，然后将每组的一种正确培养物通过在新鲜肉汤中稀释10-6 – 10-7来开始连续传代。再进行四次相似的连续传代，从每个阶段分离质粒DNA以进行分析。

在MDS™42中生长的pT-ITR-IL2的限制性酶切消化模式没有随传代而改变，而MG1655生长的质粒不稳定（图3）。）。KpnI消化物（单个位点）显示出较小的质粒片段，与通过内部重组使质粒重复序列之间的“锤头”区域丢失相一致。MscI消化（每个ITR两侧的位点）同样显示出片段之一的逐渐丢失，与KpnI消化一致。DNA测序证实了这些结果。

scarabgenomics由于解决了低抗原性的最初问题，质粒DNA疫苗（pDNA）受到了新的关注。这些疫苗因其快速的开发周期，温度稳定性和通过大肠杆菌发酵的廉价生产而特别有吸引力。然而，传统的菌株大肠杆菌包含移动的DNA元件，包括高达65个插入序列（IS）和至多在其基因组中有11种部分地有缺陷的噬菌体的图1。噬菌体和IS元素均可在生产过程中被激活，导致发酵结果不一致。而且，IS元件可以转座到质粒产物中图2，改变治疗剂的顺序和功能；导致细菌IS元素可能在给药后进入哺乳动物基因组。幸运的是，可以通过在pDNA生产的所有步骤中使用大肠杆菌的多个缺失菌株（MDS）消除所有这些问题。这些菌株经过精确设计，可以去除所有噬菌体和转座序列

Scarab Genomics，LLC成立于2002年，目的是将清洁基因组 ®多重缺失系列（MDS）大肠杆菌商业化，这是由麦迪逊威斯康星大学的Fred Blattner博士的研究产生的。金龟子基因组学已在威斯康星州校友研究基金会获得了专利授权的全球范围内的简化基因组技术。

通过删除超过20％的K-12基因组，对CleanGenome®E.colí进行了生物工程改造。使用合成生物学方法，进行了一系列精确的删除，包括消除了非必需基因，重组基因和移动DNA以及隐性有毒基因。减少基因组可以优化这些大肠杆菌菌株的生产，从而提高遗传稳定性和代谢效率。从常规克隆到大规模生产生物制药，CleanGenome®E.colí是广泛应用的首选菌株。

清洁Genome® 大肠杆菌菌株的 好处

• 减少的宿主介导的重组可克隆出“不可克隆的”

• 缺少IS元素可维持克隆完整性

• 富媒体和最少媒体的强劲增长可带来高产量

• 去除腐皮防止过早溶解

• 发酵罐高密度生长

• 经过验证的基因组减少

与传统的常用大肠杆菌宿主相比，CleanGenome®菌株在实验室克隆，质粒DNA产生和重组蛋白表达方面具有许多独特的优势。圣甲虫的MDS菌株的特殊优势对于生物治疗药物的生产尤其重要。带有附加基因组缺失的MDS菌株已经制成，目前正在测试中。

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