新型冠状病毒及其疫苗的全面解读_蛋白

原标题：新型冠状病毒及其疫苗的全面解读

COVID-19和SARS-CoV-2是什么

随着新冠疫情的爆发以及科学研究的不断进展，COVID-19 和SARS-CoV-2 这两个英文单词不断的出现在人们的视野里，这究竟是什么，它们有什么关系？COVID-19 是WHO 命名的由新冠病毒导致的疾病名，COVID 由Corona （冠状）、Virus （病毒）和Disease （疾病）三个单词组合而来，19 代表2019 年。SARS-CoV-2 为引起COVID-19 的病毒名。

SARS-CoV-2的R0值

SARS-CoV-2 感染性极强，自从2019.11 爆发以来，已经蔓延至188 个国家，25 个领土。R0 是用来衡量传染性的参数，它的大小取决于各种生物、环境和社会行为因素。SARS-CoV-2 的R0 值为2-3 ，而西班牙流感R0 值为0.9-2.1 。

SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV

冠状病毒是一种+RNA 包膜病毒，表面主要由S 蛋白覆盖。基因分析表明SARS-CoV-2 和SARS-CoV 存在79% 相似度。SARS-CoV-2 和SARS-CoV 拥有共同的宿主受体人血管紧张素转换酶2 （hACE2 ），但SARS-CoV-2 比SARS-CoV 结合hACE2 能力更强。尽管二者相似度很高，但却没有交叉保护效果。MERS-CoV 与SARS-CoV-2 相似度为50% ，MERS-CoV 受体为DPP4 ，而不是hACE2 。

SARS-CoV-2中非结构蛋白和结构蛋白

SARS-CoV-2 基因组包含至少10 个ORF 。ORF1ab 转化为一种多聚蛋白，被加工成16 种非结构蛋白(NSP) 。这些NSP 具有多种功能，如基因组复制、诱导宿主mRNA 切割、膜重排、自噬体产生、NSP 多聚蛋白切割、封盖、加尾、甲基化、RNA 双链解螺旋等，在病毒生命周期中具有重要作用。除此之外，SARS-CoV-2 含有4 种结构蛋白，即刺突（S ）、核衣壳（N ）、封套（E ）和膜（M ），均由病毒基因组3’ 端编码。在这4 种结构蛋白中，S 蛋白是一种体积较大的多功能跨膜蛋白，在病毒吸附，融合，注入宿主细胞过程发挥重要作用。

1 、S 蛋白由S1 和S2 亚基构成，每个亚基可进一步分成不同功能结构域。S1 亚基有NTD 和RBD 2 个结构域，RBD 中含有保守的RBM 。S2 亚基有FP 、HR1 和HR2 3 个结构域。S1 亚基排布在S2 亚基顶端形成免疫显性S 蛋白。

病毒利用宿主跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2) 和内体半胱氨酸蛋白酶CatB/L 进入细胞。TMPRSS2 负责S 蛋白的裂解，以暴露S2 亚基的FP 区，该亚基负责启动内体介导的宿主细胞进入。表明TMPRSS2 是病毒进入所必需的宿主因子，因此，使用抑制这种蛋白酶的药物可以达到治疗目的。

SARS-CoV-2 通过S 蛋白与人hACE2 结合靶向细胞。冠状病毒通过构象掩蔽和糖屏蔽使S 蛋白逃脱免疫系统攻击。冷冻EM 揭示S 蛋白外结构域三聚体具有开放和关闭2 种构象，这种构象变化对与hACE2 结合至关重要，因为三聚体开放可以暴露RBM 。

图1 TMPRSS2抑制剂萘莫司他具有治疗作用

图2 SARS-CoV-2 结构蛋白示意图

2 、E 蛋白形成E 通道，在病毒复制周期中发挥多种功能，包括整合、释放、致病机制等。这些离子通道以同源五聚体形式存在，每个亚基含有50-120 个氨基酸。E 通道含有至少1 个TMD ，这有利于与宿主细胞膜连接。

3 、在病毒颗粒中，M 蛋白是中心组织者，通过与必需的结构蛋白相互作用，在SARS-CoV-2 的形态发生和组装中起着至关重要的作用。M 和N 蛋白的结合稳定了N 蛋白和RNA 复合物，以及病毒的内部核心。在SARS-CoV 中，M 蛋白也被证明能诱导宿主细胞凋亡。N 蛋白具有稳定病毒粒子ssRNA 的作用，是抗病毒RNAi 拮抗剂，也负责抑制宿主细胞进入S 期（DNA 合成期）。

疫苗开发需要谨慎的验证和不良反应评估。疫苗目标人群包括60 岁以上的高危人群（特别是患有慢性病的人），一线医疗工作者和从事必需品行业的人。S 蛋白是制备疫苗的主要抗原，其中和血清可为机体提供保护。SARS-CoV-2 全长5500 基因组已在NCBI 发布，为疫苗研发提供基础。截止2020 年7 月2 日，全球已有158 个SARS-CoV-2 候选疫苗，其中135 个处于临床前或研发阶段。疫苗开发的平台包括蛋白亚单位疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗（DNA 、RNA ）、减毒活疫苗和被动免疫，每种疫苗都有各自的优势与劣势。

一、蛋白亚单位疫苗

该类疫苗通常低免疫原性，需要配合佐剂使用才能诱导免疫。佐剂增强了抗原物质的生物半衰期或改善了免疫调节细胞因子，弥补了亚单位疫苗的缺陷。SARS-CoV-2S 蛋白是诱导中和抗体最合适的抗原。病毒通过S 蛋白与hACE2 受体介导的内吞作用进入细胞。S 糖蛋白具有构象变化，因此，为了更好的诱发抗体反应应该保留其抗原结构和构象。

1 、NVX-CoV2373

NVX-CoV2373 是基于融合前S 蛋白的重组纳米疫苗。该蛋白由杆状病毒稳定表达，设计使用Matrix-M 佐剂增强免疫效果。动物实验中，单次免疫即可获得高水平抗体，可阻断SARS-CoV-2 与hACE2 受体结合。

2 、PittCoVacc

一款rSARS-CoV-2 S1 和rSARS-CoV-2-S1fRS09 组分的微针剂配方。在临床前实验小鼠模型中，接种2 周后，可检测到具有统计学意义的抗体。而且，该疫苗免疫原性在经过γ 射线无菌处理后仍然保留。强化免疫前，即可获得具有统计学意义的抗体水平使该疫苗具有可行性。

3 、三 组分抗原疫苗

一款由酿酒酵母表达平台（D-Crypt TM ）共表达SARS-CoV-2 重组S 、M 、E 的多抗原病毒样颗粒，其有望进入临床前试验。

二、病毒载体疫苗

病毒载体疫苗可长期提供高水平抗原蛋白表达，诱导CTLs ，最终清除病毒感染。

1 、Ad5-nCov

一款由重组、复制缺陷5 型腺病毒（Ad5 ）载体表达的SARS-CoV-2 重组刺突蛋白的疫苗。将优化的全长S 蛋白基因连同血浆酶原活化信号肽基因载入E1 和E3 缺失的Ad5 载体中。该疫苗由源自MicrobixBiosystem 的Admax 系统构建。I 期临床实验中，免疫后14 天RBD （S1 亚基受体结合域）和S 蛋白中和抗体增强4 倍，在28 天达到高峰。免疫后14 天CD4+T 、CD8+T 细胞达到高峰。已经存在的Ad5 免疫抗性部分限制了抗体和T 细胞反应。本研究将进一步在18-60 年龄段人群中进行，接受1/3 研究剂量，免疫后随访3-6 个月。

2 、Coroflu

M2SR 是一种自限型流感病毒，在其中插入SARS-CoV-2 刺突蛋白基因序列制备疫苗。该疫苗还可表达流感病毒血凝蛋白，诱导双重免疫反应。M2SR 由于缺少M2 基因无法实现复制，但可以进入细胞，诱导免疫反应。可通过鼻内（模仿自然感染模式）免疫，活化多种免疫系统模式，与肌肉注射比较，可获得高水平免疫效果。

3 、LV-SMENP-DC

使用SMENP minigenes 实现表达SARS-CoV-2 结构蛋白和蛋白酶保守结构域的慢病毒感染工程化树突状细胞，得到LV-SMENP-DC 疫苗。皮下免疫激活CTLs 。

4 、ChAdOx1

经过密码子优化的SARS-CoV-2 S 蛋白编码序列，在其5’ 末端引入组织血浆酶原活化（tPA ）先导序列，克隆至穿梭质粒。该穿梭质粒在Gateway 重组克隆位点间编码人类巨细胞病毒(IECMV) 的主要早期基因，以及四环素操作(TetO) 位点和牛生长激素(BGH) 多腺苷酸信号。将SARS-CoV-2S 基因插入ChAdOx1 腺病毒基因组的E1 位点，病毒在T-Rex293HEK （人胚胎肾293 ）细胞系中繁殖，通过CsCl 梯度超速离心纯化。临床前试验中，肌内接种动物实验表现良好免疫反应。该疫苗已进入二期临床试验，增大样本评估数量。

三、mRNA 疫苗

mRNA 疫苗不具感染性，没有插入突变风险。包括非复制RNA 和病毒驱使自复制RNA 。通过优化可增强mRNA 的疫苗稳定性，降低载体免疫原性，避免抗载体免疫，实现可重复免疫。该平台增强了快速疫苗开发的能力，具有设计灵活性以及模仿自然感染过程的优点。

1 、mRNA-1273

编码SARS-CoV-2 全长，融合前刺突蛋白的mRNA 包裹入脂纳米颗粒形成mRNA-1273 疫苗。其可诱发高水平S 蛋白特异性抗病毒反应。也可由灭活抗原或亚单位抗原组成。该疫苗被FDA 迅速批准，已进入II 期临床试验。公司已经公布接受不同免疫剂量的8 位受试者的抗体数据。25ug 剂量组获得了类似康复期抗体水平的效果。而100ug 剂量组，超过了康复期抗体水平。在25ug 和100ug 剂量组疫苗基本安全和耐受，而250ug 剂量组出现了3 级系统症状不良反应。

2 、BNT162b1

BNT162b1 是编码SARS-CoV-2 密码子优化RBD 三聚体mRNA 疫苗。由于在RBD 抗原中加入T4 纤维蛋白衍生折叠三聚体结构，增强了疫苗的免疫原性。mRNA 包裹在80nm 可离子化阳离子脂纳米颗粒中，这样可以确保其有效递送。1/2 期临床实验揭示RBD 特异性IgG 抗体水平较康复期血清几何平均浓度高8-46.3 倍。而SARS-CoV-2 中和抗体几何平均浓度仅为康复期血清水平的1.8-2.8 倍。中等强度短暂的局部和系统反应未表现为副反应。二次免疫2 周后的免疫反应和安全性尚未评估。

四、DNA 疫苗

引入抗原编码DNA 和佐剂作为疫苗是最具革新的疫苗方法。转染细胞稳定表达转基因蛋白，类似于活病毒。抗原会被未成熟DC 内吞，最终向CD4 + T 、CD8 + T 细胞提供抗原（通过MHC 区别）从而诱发体液和细胞免疫。

INO-4800

使用SARS-CoV-2 密码子优化S 蛋白序列，附着IgE 先导序列。SARS-CoV-2 IgE 刺突序列经过合成和酶切，载入pGX0001 表达质粒，在IE CMV 和BGH 多聚腺苷酸信号下驱动。免疫后7 天可诱发有效免疫反应。已进入I 期临床实验，估计7 月前完成。受试者通过电转化接受1.0mg 的INO-4800 。皮内注射和电转化健康受试者均表现为安全与耐受。

五、减毒活疫苗

DelNS1-SARS-CoV2-RBD

流感基础疫苗，删除NS1 基因。表达SARS-CoV-2 RBD 结构域。在CEF 和MDCK （犬肾细胞）细胞中培养。比野生型流感病毒更具免疫原性，可通过鼻喷雾给药。

六、其他

随着SARS-CoV-2 结构和基因组了解的深入，各种疫苗迅速开发。具有潜在免疫效果，也存在副反应。疫苗开发是一个长期、繁重的过程，需要长期评估。各生物企业使用不同技术开发疫苗。BAT 公司使用新型，快生长烟草制备COVID-19 疫苗。天津大学通过酿酒酵母携带S 蛋白开发口服疫苗。通过热激蛋白（HSP ）活化免疫系统，在HSP 和亲和素（Avidin ）间形成融合蛋白，以生物素化免疫多肽形式实现疫苗制备。

七、被动免疫

就是使用抗体来治疗疾病，包括康复期病人血清，在其他动物体内生成的多克隆抗体，杂交瘤技术生产的中和单克隆抗体或人源化抗体。

1 、康复期血清

截至目前，对COVID-19 没有特效疗法。康复期血清（CP ）疗法一致认为是紧急应对疾病爆发的疗法。曾用于治疗和预防SARS ，MERS ，H1N1 ，麻疹，腮腺炎等。一种可能的解释为中和抗体可以克服病毒血症，阻断新的感染，加速感染细胞清除。

为了评价CP 的使用效果，进行了各种实验，一致表明中和抗体在危重病人可以改善临床状况而不会出现死亡。CP 治疗剂量没有规定，需要通过随机临床实验一方面排除其他药物效果，并评估CP 疗法的效果和安全性。危重病人有类似的症状，如高血压，心血管疾病，胸血管疾病，慢性肾衰竭等也计入研究中。他们都进入ICU ，接受呼吸机。所有这些病人都接受抗病毒，抗细菌或抗真菌药物治疗。与对照相比，CP 治疗组在基线特征方面没有什么显著区别，但在临床结果方面展现了极大不同。如体温正常化，肺病变吸收，ARDS 急性呼吸窘迫综合征缓解，摘去呼吸机，降低死亡率。CP 治疗7-37 天后病毒负载为0 。炎症因子如CRP ，原降钙素，IL-6 降低，同时RBD 特异IgM 和IgG 增加。这些不受控，非随机的试验阻碍了科研人员对该疗法的评估，需要在临床实验中继续评估。

2 、单克隆抗体

单克隆抗体由实验室制备，来源于一个病人，单价亲和性。单克隆抗体不存在康复期血浆在特异性，安全性，血源性感染低风险性，纯度，其他因素等方面的弊端。已经开发了多种单抗用于抗肿瘤，抗血小板或抗病毒治疗。

目前超过61 个专利制备SARSMERS 诊断抗体。其他38 个专利开发靶向宿主蛋白如IL-6/IL-6R,TLR3,CD16,ITAM,DC-SIGN,ICAM-3,IP-10/CXCL10 抗体。这些抗体可以抵抗细胞因子风暴，减轻SARS-CoV-2 感染。托珠单抗，IL-6 受体抗体可控制高炎性肺症状。托珠单抗可以阻断细胞因子IL6 ，因此抑制炎性级联。还需要临床实验进一步确定单抗有效性。

SARS-CoV-2疫苗开发中存在的困难

1 、疫苗开发时间长，而疾病爆发迅速

SARS-CoV-2 的流行导致了经济活动的大幅终止，SARS-CoV-2 的防治需要全球科学家携手合作，与制药巨头和医疗初创企业建立创新的合作关系，以重新利用药物、开发疫苗和设备，阻碍这一压倒性流行病的进展。疫苗的开发过程是一个艰苦的过程，包括临床前和三期临床阶段。为了加速疫苗研发，在具有足够数据支持下，考虑跳过某些阶段，通过快速监管审查、批准、制造和质量控制，加快疫苗产出。因此，新冠病毒的出现迫使科学界使用非常规方法来加速疫苗的开发进程。但无论何时，疫苗开发都应具备以下原则：高效力，只有轻微或短暂的不良影响，不会导致严重的疾病。疫苗必须适合各年龄人群，包括孕妇和哺乳期妇女。单剂量免疫即可提供快速保护，并至少存在一年保护效力。

2 、常规动物模型不适用于SARS-CoV-2 疫苗研究

疫苗开发和测试需要动物模型支持，这些动物模型必须显示出与人类相似的疾病过程。然而，由于人和小鼠hACE2 受体的差异，标准自交系小鼠不容易受到SARS-CoV-2 感染，这需要开发转基因小鼠，表达hACE2 受体。为研究SARS-CoV 开发的hACE2 转基因小鼠模型和灵长类猕猴模型，目前需要解决稳定繁殖和适应全球使用的问题，以满足研究需求。SARS-CoV-2 病毒分离物可有效的在叙利亚仓鼠肺部复制，受感染仓鼠肺部表现出类似于COVID-19 肺炎患者的病理变化。此外，受感染的仓鼠产生的免疫反应可抵御再次感染。向健康仓鼠输入康复期血清可阻碍病毒在肺部复制。这些实验表明，叙利亚仓鼠可作为研究SARS-CoV-2 发病机制，评估抗病毒药物和免疫治疗的动物模型。然而，疫苗依赖免疫增强的评估不能从动物模型中推断出来，需要从III 期临床试验中证实。

3 、抗体依赖性增强(ADE) 和病毒基因组突变

1964 年，澳大利亚国立大学的Hawkes 团队首次在虫媒病毒中提出了“抗体依赖性增强”（ADE ）的假说。即某些病毒特异性抗体（一般多为非中和抗体）与病毒结合后，不但不会抑制病毒感染，反而会充当一个“桥梁”的作用，介导病毒进入细胞，从而增强了病毒的感染性过程。之后的研究发现，ADE 效应广泛存在于诸如，登革热等黄病毒、冠状病毒、HIV 、埃博拉等多种病毒之中，是流行病学、疫苗抗体研发的一大研究重点和难题。

图3 抗体ADE 示意图

以登革病毒为例，登革病毒有4 种不同的血清型(DENV1 —4) ，当病毒亚型DENV-1 侵入机体，机体的免疫细胞会产生对应的抗DENV-1 中和抗体。然而，当再次感染另一血清型病毒DENV-2 时，之前产生的抗DENV-1 中和抗体会首先与DENV-2 病毒结合，但不会中和该病毒，反而与免疫细胞上的lgGFc 受体结合，促进病毒侵染这些细胞的过程，从而加重感染。之前的研究发现，依靠Fc 受体（FcR ）介导的ADE 效应，主要通过抗体Fc 片断与细胞表面FcR 的相互作用使病毒—抗体复合物与具有FcR 的细胞结合（包括巨噬细胞、单核细胞、B 细胞、嗜中性白细胞和粒细胞等），使病毒黏附于细胞表面，促进感染。

在依靠补体受体（CR ）介导的ADE 效应中，病毒表面蛋白可以结合不同血清型的抗体，激活补体系统的经典途径。补体C1q 与附着在病毒表面的蛋白质结合，从而通过结合存在于细胞表面的C1q 受体使病毒与细胞相互靠近，导致病毒感染细胞。

除上述两种外，也发现了如病毒表面蛋白介导的ADE 效应、抗体模拟细胞受体与病毒结合的ADE 效应等多种ADE 效应机制。

尽管目前还尚未在新冠病毒抗体和疫苗的研究中发现明显的ADE 效应，但是在之前的SARS-CoV 和MERS-CoV 的研究中就已经发现了存在ADE 效应。由于ADE 效应的影响，部分疫苗也曾因为缺乏对ADE 效应的认识而导致了严重的公共卫生事件。因此，深入地研究ADE 效应机制，找寻产生ADE 效应的规律，可以帮助我们成功避免ADE 效应带来的危害。

目前，普遍的认为可以通过设计能保证在体内诱导出高效价中和抗体的疫苗，以及能同时诱导产生细胞免疫和体液免疫等措施，可以有效避免ADE 效应的产生。一些研究也发现，在HIV 的疫苗设计中，如果去除感染增强性表位，保留中和表位，可以产生较好的免疫保护作用。另外，使用适当的药物阻断FcR ，与疫苗或抗体联合治疗病毒感染也是一种可有效抑制ADE 的策略。在新冠病毒的抗体研发上，为了避免ADE 效应，Shi Rui 等人也在抗体CB6(CB6-LALA) 的Fc 部分引入了LALA 突变，以降低Fc 介导的急性肺损伤的风险。

不过，要想成功避免ADE 效应，首先应该要解决的一个问题，就是哪些抗体和病毒会导致ADE 效应？它们的共同点在哪里？只有明白了ADE 效应的具体机制以及形成规律，才能有效避免ADE 效应的产生。

病毒基因组易突变，可发生抗原转移和漂移，并在群体中传播。突变可因地理区域的环境条件和种群密度而不同。对感染病人的7500 个样本进行筛选，科学家们找出198 个突变，表明病毒在人类宿主体内的进化。这些突变可能形成不同病毒亚型，这意味着即使经过疫苗免疫，也可能会出现病毒感染。

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