特征性研究：内源性GPCRs 细胞功能图研究

前言

G-偶联蛋白受体（GPCRs），即7-跨膜蛋白，是当今临床与科研药物的单一治疗靶点，也是迄今发现最大的靶点家族。据推测人基因组中，该家族的功能成员超过300个，涉及多种不同细胞与组织间的广泛信号途径。研究证实，对GPCR功能的调节，有助于免疫学、神经病学、心脏病学与肿瘤学领域多种疾病的治疗。

通过应用新的基于细胞水平的受体功能检测技术，候选药物对新调节子的确认率显著提高，损耗率（定义为临床前检测/临床试验失败率）降低。但基础研究获得的GPCR功能数据很难被应用于临床疾病中。造成这种情况的原因是，传统细胞学实验往往（1）使用异源细胞，或相关性较低的细胞类型，进行人造受体的过表达；（2）使用外源性检测试剂，如荧光标记试剂；（3）使用侵入性处理手段，像染料负载以及细胞裂解，（4）生成的数据仅为单一时间点的数据，而不是持续性细胞监测数据。

最近开发的生物相关性程度更高的实验系统，可显著改善GPCR药物开发与研究应用的成功率⁽¹⁾。罗氏应用科学部的xCELLigence系统，不需要使用外源性标记，即可对疾病相关细胞的内源性GPCR功能进行实时评测。将细胞接种于含有微电极的培养板上，可对GPCR激活导致的细胞骨架结构的微小变化与细胞收缩情况进行准确测定。

通过与细胞浆鸟嘌呤核苷结合蛋白或G蛋白结合偶联，GPCRs可进行细胞的信号传导活动。所有主要的与G蛋白偶联的第二信使通路，都已被发现会激活环化AMP/蛋白激酶A、钙离子/磷酸酶C、β-抑制蛋白/MAPK，以及Rho家族GTP酶，使细胞发生形态学改变。而xCELLigence系统可通过记录细胞阻抗，很容易对形态学改变进行检测(2)，从而完成对GPCR的检测。

与传统检测方法相比，形态学阻抗测定可对多个信号途径累积效应进行捕获。内源性GPCR功能测定的优势包括（1）对靶受体进行评价是在其正常表达水平上；（2）在调节因子包括激素或异源性二聚体存在情况下，对受体之间的天然相互作用情况进行分析；（3）允许GPCR与细胞内G蛋白的天然偶联。同时，应用实时无标记xCELLigence检测系统，可动态实时地记录实验期间的所有阻抗信息，从而对所有GPCR的反应进行检测。通过单一检测即可对GPCR激活导致的所有第二信使途径进行测定，从而有效降低试剂成本。

本研究中，我们发现xCELLigence系统是一种灵敏的、可靠的检测系统，用于持续内源性GPCR功能测定。研究中我们对涉及24个治疗相关受体家族的一组43个配体（参见表1）进行了测定，并生成了相关GPCR功能图谱。实验涉及通用的肿瘤细胞系、HeLa、U2OS、SH-SY5Y与CHO-K1，以及疾病相关的原代细胞：人血管内皮细胞与混合肾上皮细胞。

表1：GPCR功能图概述

材料与方法

细胞系与培养条件：细胞系来自于ATCC。按照ATCC的建议进行HeLa（#CCL-2）、U2OS（#HTB-96）、SH-SY5Y（#CRL-2266）、CHO-K1（#CCL-61）、人血管内皮细胞（HUVEC；#PCS-100-010批号58570370）与混合肾原代上皮细胞（MREC；ATCC#PCS-400-012lot#58488854）的培养，肿瘤细胞系传代至10代以上，原代细胞系传代至4代。

检测程序：所有检测均于组织培养器（5%CO2，37°C）中进行。细胞培养基为生长培养基，细胞接种密度是1-2x104细胞每孔，接种于96孔E-Plates中，并通过xCELLigence系统进行过夜监测，直至细胞生长至接近满板，复孔检测。预先在另一普通96孔板中每孔中添加2µl药物，并储存于-20℃。待细胞培养18-24小时后，进行药物稀释反应。将药物融解，并添加132µl检测缓冲液（1xHBSS，SigmaH8264、20mMHEPES，Cellgro25-060-Cl、0.1%BSA，FisherScientific#BP1600）对其进行稀释处理。从培养箱中移除E-Plates96，使用检测缓冲液进行洗涤，洗涤一次，并使用BiotekMicroFloSelect，于每孔中添加140µl检测缓冲液。将E-Plates96放回至RTCAMP站，放置15分钟，进行细胞平衡。然后使用BeckmanMultimek96，同时在各孔添加10µl的药物缓冲液。小分子药物实验最终浓度为10µM，多肽为1µM。

数据分析：使用RTCA软件，对每孔的数据在药物添加前时间点进行标准化处理。对于各种药物，在计算时需减去只含药物溶剂时对照细胞表现出的背景值。小分子药物相应溶剂为DMSO，多肽药物相应溶剂为0.1%的BSA。

将检测结果数据导出至MicrosoftExcel，进行后续计算。确定每孔细胞的最大与最小细胞指数值，计算重复检测（n=2）的均值标准差与平均值。对于对照孔细胞来说，对重复检测8个孔的均值标准差进行测定。将这些数值平均并乘以3以计算"hit"阈值。对于Z因子与EC₅₀计算来说，使用RTCAMP提供的动态反应曲线，选择一时间点作为细胞系及药物综合反应的最佳时间点。

结果

为确保研究的重现性，细胞为可靠来源，并可确保细胞的质量与类别。所有实验细胞均来自于美国细胞菌种库（ATCC）。检测前，进行有限传代，按照ATCC的建议进行细胞的保存。

内源性GPCR检测稳定性。检测各种条件下HeLa细胞对内源性GPCRs激活剂的反应性。且将钙离子载体A23187作为阳性对照，并对其进行检测。低浓度情况下，由于Gq-偶联GPCR的激活，A23187可模拟钙离子的活化过程。由于其独立于GPCRs的表达，这种反应有助于细胞检测条件的研发。最强烈反应出现于过夜长满平板的细胞。此时使用GPCR检测通用缓冲液更换掉生长培养基（参见详细检测条件中的材料与方法）。

按照这些检测条件对几种不同细胞系对A23187与1-磷酸鞘氨醇（SIP）的反应进行评价，SIP是无所不在的GPCR表达家族、溶血磷脂或内皮分化基因（EDG）受体的内源性激活剂。Z量测因子考虑有信噪比与检测的变异性，用于对检测强度进行评价⁽³⁾。使用终浓度1µM或与缓冲试剂（0.1%BSA）相同浓度的S1P与终浓度100nM或与其缓冲试剂（DMSO）相同浓度的A23187对8个重复多孔培养的细胞进行处理。使用xCELLigence系统，对细胞反应进行实时监测，间隔时间1分钟。

激活剂添加后最初几分钟期间，即开始检测细胞反应。每种细胞系中，添加激活剂后的最初30-40分钟期间细胞反应最大（参见图1）。如图所示，处理后接近30分钟时，HeLa细胞对A23187的反应最大，对S1P的反应接近最大。此时，A23187与S1P的Z因子分别是0.83与0.90。所检测的细胞类型中，两种处理中至少一种Z因子分值超出0.5，表明检测可靠性高（参见表2）。相反，两种配体混合的原代肾上皮细胞（RMEC）Z因子接近0.25，表明检测可靠性不显著。但后续GPCR筛查检测结果表明，该细胞类型其他GPCRs可靠性更高。

图1：GPCR检测可靠性评价。HeLa细胞接种密度是10000细胞每孔，接种于E-Plate96上，放置于xCELLigenceRTCAMP仪器，并在培养箱中过夜。然后去除生长培养基，添加检测缓冲液，持续细胞监测15分钟后，添加GPCR调节药物，记录每分钟细胞反应情况，记录1.5小时。获得时间依赖性细胞反应曲线。八复孔，误差列代表均值标准差。药物添加后30分钟，计算单一时间点Z因子值检测质量。DMSO是A23187试剂对照；0.1%BSA用于S1P。SD=标准差；ABS=绝对值。

图2：GPCR检测灵敏性评价。如图1方法，对HeLa细胞进行检测，每种药物以8个浓度处理细胞。使用RTCA软件，通过计算药物添加30分钟后每种药物的EC₅₀值，对检测灵敏性进行测定。

内源性GPCR检测灵敏性。我们也使用A23187与S1P，以及8点剂量反应曲线检测实验灵敏性（参见图2）。于Z因子测定相同时间点，通过RTCA软件计算产生50%最大反应（EC₅₀值）的激活剂浓度。

每种细胞系的EC₅₀值见表2。每种细胞对A23187的处理均比较敏感，除CHO-K1外，所有细胞类型对S1P的处理均非常敏感，产生的EC₅₀值低限为10-7至10-9。尽管CHO-K1细胞表达EDG受体(4)，后续检测S1P与溶血磷脂酸（LPA）反应分值为阳性（见下文），但是为生成准确的EC₅₀，很明显，这里所用的剂量不足以饱和生物反应。

内源性GPCR功能图。优化检测参数后，使用治疗相关GPCRs的一组43个小分子与多肽调节子，对本研究中所用的细胞类型的功能反应进行检测（参见表1）。该组药物指向的24个受体家族，包括50种潜在性反应受体，代表所有主要的GPCR偶联类型（Gs、Gi、Gq、G_12/13）。使用上文程序进行复孔检测各细胞类型。

表2：检测开发与评价概述

四种肿瘤细胞系HeLa、CHO-K1、U2OS与SH-SY5Y对每种药物都会生成独特的时间依赖性细胞曲线（time-dependentcellularresponseprofile，TCRP）（数据未显示）。我们对每孔最大与最小细胞指数值进行测定，该指数值与时间点无关，并以该数值均值与标准差作图（参见图3）。GPCR功能图表明，对能引发反应的配体而言，细胞指数值的增加或降低具有显著差异。例如，HeLa细胞显示的细胞指数正向改变程度较大，CHO-K1细胞显示的细胞指数负向改变程度较大，包括同样受体家族中的GPCRs，如PGE1、2与Iloprost激活前列腺素类受体（参见图3）。这些结果表明，细胞背景差异可显著改变对同样刺激物的形态学反应，这可能是由于G蛋白偶联的差异，或下游信号传导途径的差异，这些差异可使细胞形态学发生改变。细胞指数值的总体模式同样也可反映出不同GPCR配体的相对特异性。SDF1a，即CXCR4内源性激活剂，仅可于HeLa细胞中，诱导出强大的正向细胞指数反应，而降钙素仅可诱导出CHO-K1细胞的强大的负向细胞指数反应。我们也对两种附加肿瘤细胞系：SH-SY5Y神经母细胞瘤与U2OS骨肉瘤细胞，以及两种原代细胞类型：人血管内皮细胞（HUVEC）与混合原代肾上皮细胞（这里简称MREC）的GPCR配体进行检测。

为测定细胞系的相应活性配体，我们将8个对照孔的最大与最小细胞指数反应值与固有变异性进行比较。细胞指数值超出或低于对照孔细胞检测值的三个标准差的检测孔细胞被视为呈活性反应。配体诱导活性反应见图3与4。每种细胞相应内源性GPCR见表1。

一种或更多细胞类型中，有14种受体家族被确认为活性反应。多种情况下，本研究中使用的内源性配体可激活同样受体家族的多个成员。例如，血清素可激活所有内源性血清素受体，包括几种亚家族，其中几种亚家族具有多种亚型。总之，研究证实，对一种或更多的肿瘤细胞，以及本研究所用的原代细胞中，xCELLigence系统细胞指数图是一种可靠的方式，可用于对14种不同GPCR家族进行功能检测。

图3：肿瘤细胞系GPCR功能图。指定类型细胞的检测如图1所示，于反应板单孔中，对细胞添43个GPCR调节药物后的反应进行评价，并进行复孔重复。测定每孔最大与最小的细胞指数值（参见材料与方法）。使用RTCA软件，减去每时间点缓冲液对照孔的平均基线细胞指数值，从而对数据进行标准化处理（参见详细文本说明）。因此对照孔细胞指数值为零。误差列代表监测时间窗内培养孔的标准差。以反应孔的处理细胞的重复多个细胞指数值（两个重复多个反应板，n=2）均值作图。误差列代表重复多个细胞指数值的一个标准差。红色虚线代表对照孔的3倍标准差。明确导致细胞指数值增加（绿色线）或降低（红色线）的药物以实线框加强；无显著统计学意义的数据（低于3倍标准差-临界值）以虚线框显示。

图4：原代细胞GPCR功能图。如图3所示，对指定细胞类型的原代细胞进行检测。

讨论

xCELLigence系统的实时无标记细胞检测技术可加速药物开发进程，并使基础研究成果更快的应用至临床中。我们的研究显示，通过xCELLigence系统，可对肿瘤细胞系与原代细胞的GPCRs功能进行检测。目前研究显示，一种或更多的细胞系中，检测的大多数受体靶GPCR家族可产生稳定反应，反应强度高于对照孔细胞均值的三倍标准差。以同样方式对多种细胞类型进行检测，除本文列出外，还可发现更多的内源性GPCR检测数量。已检测的部分配体可激活GPCR家族多个成员。通过所选基因表达图的激动剂与拮抗剂附加实验，以及单一受体siRNA敲除检测，可对xCELLigence系统检测到的，引发形态学改变的特异性受体亚型进行确认。

结论

oxCELLigence系统可对广泛的内源性GPCRs功能进行检测。

oxCELLigence系统进行的GPCR检测，灵敏性与稳定性非常高。

oxCELLigence系统进行的GPCR检测GPCR检测，可用于癌细胞系与原代培养细胞系。

参考文献

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英文版：FunctionalCellProfilingofEndogenousGPCRsusingthexCELLigenceSystem.pdf

专题：MicroRNA和癌症