RPA常见问题汇总

关于引物的问题                                                                         

PCR引物可以用于RPA吗？可以。我们最近已经证实，在许多情况下，具有PCR常用长度

（例如18-23个核苷酸）的引物可很好地用于RPA。不过要注意，反应动力学可能会稍慢，因此如果想要发挥RPA的优势，在10-15分钟内快速扩增，我们建议使用稍微长一些的引物（以及更短的扩增子）。此外还要注意，对于决定寡核苷酸作为RPA引物的因素与决定寡核苷酸作为PCR引物的因素两者之间的关联，目前尚无正式定论。

我可以使用现有的PCR 探针吗？

不可以。大多数常用的PCR探针系统不适合用于TwistAmp®检测过程。具体地说，那些利用聚合酶的5’至3’核酸酶活性的系统不能用于TwistAmp®系统，因为这种酶活性与RPA生物化学过程根本不相容。

我如何设计RPA 引物？

可以通过官网上附录（网址为twistdx.co.uk）中详细介绍的筛选过程确定好的RPA引物。

我需要使用多少引物？

TwistAmp®Basic反应的推荐引物浓度为每种480nM对于TwistAmp® exo、TwistAmp® fpg 和TwistAmp® nfo 试剂盒，推荐引物浓度为每种420nM。不过，稍微改变反应中某些引物对的用量可以提高其性能，可采用滴定策略（每次从200nM到600nM）来确定其特定引物对的最佳浓度条件。

我如何配置冻干探针？请参照寡核苷酸生产商关于探针配置和贮存的说明。

通常，将装有冻干寡核苷酸的小管短暂离心以使DNA沉降于小管的底部，加入适量的T0.1E  缓冲液（10mMTris-HCI    pH8

，0.1mMEDTA）来制备100μM的贮备溶液。将溶液在室温下静置10分钟，并混合（震荡）10秒钟。配置好的寡核苷酸探针通常可在-20°C 下长期贮存。

我需要使用多少探针？

反应中探针的推荐浓度为120nM。不过，略微改变探针的浓度有时会促进TwistAmp®反应。对不同的探针浓度（从50nM到150nM）进行测试将优化基于探针的特定检测的性能。

RPA引物需要多长？

为了充分利用RPA的检测速度和灵敏度，我们建议客户使用至少30  个核苷酸长度的引物。通常情况下，引物长度在32  至35个核苷酸之间。可使用较短的PCR长度引物，但是这类引物的检测速度和灵敏度可能不及较长的引物。

RPA引物应当相距多远？这取决于具体应用和需求。一般而言，我们建议在标准TwistAmp®试剂盒检测条件下，两个RPA引物产生的扩增子长度通常不应超过大约500bp。RPA扩增产物的大小或许没有下限，不过根据RPA引物的最小长度，扩增子长度最小大约80bp。为了获得最快速的实时反应动力学，最终扩增子的理想长度应为100-200bp。在特别优化的情况下，生成的扩增产物长达2kb。但是，标准的TwistAmp®试剂盒不容易产生这么长的扩增子。请参阅附录（网址为twistdx.co.uk）了解有关引物设计和获

得更长扩增子方法的详细信息。

我需要筛选多少引物？这取决于您对检测灵敏度的要求。举例来说，如果您只需要每个反应检测1000个分子或以上，那么绝大多数引物对都够用了。对于极高灵敏度的检测，最好是进行系统性的引物筛选以找到好的RPA引物。最初筛选时，测试的引物对数量通常在10到20对之间。测试的寡核苷酸越多，找到能够在快速动力学下检测单个分子的好引物对的几率也就越大。我可以在哪里获得有关引物设计的更多详细信息？有关引物设计的更多详细信息，请参阅附录（网址为twistdx.co.uk/support）

我需要使用探针筛选引物吗？不需要。任何检测方法都可以用来评估和比较候选引物对的性能。不过，就筛选高灵敏度的引物而言，用检测探针对扩增进行实时监控被证明是最快也是最省力的方法。

筛选引物时我应该使用什么样的条件？理论上，引物筛选的条件应尽可能接近地模拟最终检测时所要求的条件（近似的模板拷贝数、样本纯度、多重检测深度等等）。

可以提高给定引物的性能吗？稍微改动一下引物的序列可以提高RPA性能。任何给定的引物都可以通过以下方法进行优化：以单核苷酸为基础略微改变引物的长度；以及保持引物长度不变，以1bp为增量移动引物的位置。经过改动的引物，需要重新进行扩增活性的测试。

怎样才算是好引物？目前对于好引物还没有确切的设计标准，所以需要进行筛选。

RPA引物的解链温度应该是多少？

由于RPA反应是在恒温和DNA解链蛋白彻底改变DNA的解链行为的条件下进行的，因此传统的估算的解链温度不直接适用于该系统。

我该如何选择探针？

如果使用适用于探针的其中一种TwistAmp®试剂盒，请参照附录（网址为twistdx.co.uk）中描述的有关检测探针的设计指南。需要注意的是，使用首选的TwistAmp®exo探针系统在标靶区域中选择探针位置时，有一些序列限制。如果存在不合理的限制，TwistDx可帮助您设计备选检测策略。备选的TwistAmp®fpg探针系统更容易提供灵活的探针设计，但它产生的荧光信号有时不如TwistAmp®exo  探针强。

引物需要进行任何特别纯化吗？在进行引物筛选的时候，通常不需要使用特别纯化的寡核苷酸。但与用于其他技术时一样，我们注意到了引物制备质量的批间差异。因此，对于一致性要求比较严格的应用，我们建议在确定了好引物之后使用更纯的引物。

经过一种TwistAmp®   试剂盒测试的引物，能直接用于其他

TwistAmp®试剂盒么？

不一定。如果您已使用TwistAmp®Basic试剂盒设计了引物，用于TwistAmp®exo或nfo试剂盒时您还需要引入探针。这个和其他因素意味着跑胶检测、荧光检测或侧流层析检测对引物的最佳组合可能有不同的要求。通常情况下，我们发现，使用相似

序列的探针从TwistAmp®exo荧光检测转为TwistAmp®nfo侧流层析检测能够获得相当可靠的结果。但是荧光检测的最佳引物/探针组合不一定是能够提供最令人满意跑胶检测结果的引物组合，反之亦然。从DNA检测分析转为RNA检测的逆转录分析的情况更为复杂，因为逆转录酶和聚合酶对引物有着不同的偏好。就这一点而论，我们建议使用逆转录系统在RNA模板上设计RNA  检测，而不是在使用DNA  试剂盒优化后尝试转为使用RT 试剂盒。

能直接用标记的引物和TwistAmp®Basic剂盒进行侧流层析检测吗？可以。您可以根据需要使用两个经过修饰的引物来进行侧流层析检测，但我们推荐使用探针和TwistAmp® nfo 试剂盒。这是因为RPA与PCR一样，会受到引物二聚体形成的影响。如果引物设计不完美，引物很容易发生交叉反应，生成假阳性结果。TwistAmp® nfo 探针能够避免这个问题，因为它们被封闭，所以无法延伸形成探针-引物二聚体。nfo酶只有在与互补链结合时才能识别并切除无碱基位点(THF)。切除无碱基位点意味着，探针的封闭端可以脱落，探针可以充当引物，从而生成可被侧流层析试纸条检测到的产物。因此，只有获得所需的扩增子，探针才能结合、被切割并延伸以形成带有反向标记引物的产物。

RPA 支持生物素或荧光标记的寡核苷酸吗?

支持。在RPA反应中，连有生物素或荧光团的引物与未修饰的引物表现差不多。我们还没有发现任何差异。

 多重检测                                                                                   

TwistAmp®反应能实现多重检测吗？可以。可以在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物对组合需要精心设计，以便每个引物对都能同样有效地工作。需要注意的是，反应中的寡核苷酸总量(nmol)不要明显超出实验方案中规定的量；如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，则应在所有存在的寡核苷酸之间分配不同引物的最大用量。另外，同时监控多个扩增事件也需要不同的探针；多重检测对检测设备以及荧光团兼容性的限制也必须予以考虑。

 定量                                                                                          

可以利用TwistAmp®反应对模板定量吗？可以。特定检测的扩增子达到可检出水平的时间，取决于反应起始时的模板量：初始模板的拷贝越多，扩增子就越快达到可检出水平。不过，利用这种“基于时间”的定量需要精心的实验设计，确保对照反应是同时开始的（例如，可以通过“镁离子的添加”进行控制）。相对“较慢”的扩增反应有助于更精确的定量。减慢扩增反应速度的策略（包括合适引物的设计）在附录（网址为twistdx.co.uk）中讨论。

 Twista 兼容性                                                                       

可以在Windows8 设备上运行Twista®  吗？

Twista®  与Windows8 系统不兼容，因此您必须安装Windows

早期版本（XP Vista 或7）的仿真程序才能运行Twista。

 设置                                                                                          

试剂盒在运输时处于常温，它还能使用吗？可以，试剂盒处于常温下2-3周不会有问题，仍然可以使用。如果您不确定，请运行对照测试并将结果发送给我们，我们将能确定实际情况是不是这样。对于长期贮存，我们建议贮存在

-20˚C 下。

可以将再水化溶液的每一种成分直接依次添加到冻干的反应球团中吗？不可以。将一种引物或探针先于另一种加入体系将会导致重组复合物的形成偏向先添加的寡核苷酸。这就是引物和探针必须同时添加的原因。

可以将醋酸镁添加到重悬缓冲液中吗？

如果您在使用TwistAmp®Basic、nfo或fpg反应体系，是可以添加的。不过一旦加入镁离子，反应组分就被激活。在最后用移液器将醋酸镁移取至反应中时，我们建议可将醋酸镁添加到联排反应管的盖子上并将其离心旋转至反应体系中，如此您便可确保反应同时开始，并将交叉污染或移液枪头上残留的任何反应残液生成RPA产物的风险降至最低。

如果您在使用TwistAmp®exo或TwistAmp®exoRT反应体系，则不可以添加。在有镁离子存在时，引物和探针在受到重组酶和单链结合蛋白保护之前可能被核酸外切酶破坏。这可能会导致反应中出现很高的荧光基线。

可以制备预混液吗？可以。如果您想建立多个反应，可以制备预混液。在筛选不同的DNA时，可以将重悬缓冲液、引物和探针（如使用）混合在一起，并加入到冻干的反应物中进行重悬。然后将不同DNA加入反应体系，最后照常用MgAc起始反应。在进行引物筛选时，可以用重悬缓冲液、模板DNA、探针（如果使用）和一个引物制成预混液，并将其分装到1.5ml小管之后再分别加入不同的引物。只有当两个引物都存在时，才能重悬冻干的反应物，否则会使重组复合物的形成偏向先添加的寡核苷酸。

 运行RPA 反应                                                                       

TwistAmp®     试剂盒应在怎样的温度下使用？

标准的TwistAmp®试剂盒经过配置可在37°C-42°C的温度范围内操作。过高的温度会对反应体系产生不利的影响，因为酶会逐渐地失去全部活性。在适当的条件下，RPA过程本身可以在较低的温度下进行，但所提供的TwistAmp®试剂盒的制剂已针对高反应动力学速度进行了优化，通常不兼容使用低于推荐范围的温度条件的检测方案。对于RT试剂盒，我们建议用户在40°C下运行反应，因为逆转录酶在稍高的温度下具有更高的活性。

如果要运行TwistAmp®  反应，必须使用Twista®  吗？ 不需要。TwistAmp®Basic和nfo试剂盒适用于任何能够保持37-42°C的稳定温度的设备。对于使用TwistAmp®exo试剂盒进行的实时反应，可使用能激发并检测所用荧光发色团并能保持37-42°C稳定温度的任何孔板检测仪或实时热循环仪。注意，在运行RPA 反应时，盖加热功能应关闭。

可以使用TwistAmp®Basic反应的扩增子进行TA克隆吗？TwistAmp®Basic反应中使用的聚合酶不具有编辑功能，扩增子应该是可以用于TA 克隆的。不过，我们尚未对此进行过测试。

可以在反应体系中加入更多/更少的再水化缓冲液吗？不可以。加入比建议量更多或更少的再水化缓冲液会对RPA反应的进行方式产生不利影响。缓冲液中包含RPA反应所需的成分，因此加入更多或更少的缓冲液将会改变其在重悬球团中的最终浓度。

 检测                                                                                          

可以对扩增反应进行荧光终点分析吗？

可以，但不包括使用TwistAmp®exo试剂盒或exoRT试剂盒的情况。因为在扩增停止后，反应混合物中的核酸外切酶会消化掉大部分的扩增产物。要分析扩增子，请使用TwistAmp®Basic试剂盒。也可以对使用TwistAmp®nfo和TwistAmp®fpg试剂盒生成的产物跑胶分析。注意，如果您想对这些产物进行跑胶分析，可将TwistAmp®nfo试剂盒与TwistAmp®exo探针结合使用，但反应动力学速度会变慢。

可以使用插入性染色剂实时监控TwistAmp® 吗？可以。插入性染色剂可以在TwistAmp®反应中进行定量和监控。不过，就像PCR一样，这种染料通常可以结合到任何双链DNA上，因此引物噪音会产生假阳性信号。引物噪音在较低的温度下会更严重一些，而在PCR检测中，测量插入性染料时的温度通常是引物二聚体熔解时的温度。此外，TwistAmp® exo 试剂盒中的核酸外切酶会在反应过程中消化大部分的扩增产物，因此不推荐将插入性染料用于这类试剂盒。

跑胶之前需要回收RPA 产物吗？

需要。RPA反应体系里的集聚试剂和蛋白会干扰正常的琼脂糖凝胶电泳，如果不进行反应产物回收，跑出来的可能是弥散条带而不是干净的条带。

在用侧流层析试纸进行检测之前需要稀释RPA产物吗？需要。RPA反应体系里的集聚试剂和蛋白会干扰侧流层析试纸上的抗体，如果不进行充分稀释就会出现非特异性结合和假阳性信号。

在TwistAmp®exo(RT)反应即将结束时，有时会看到荧光急剧增强，这正常吗？

正常。在TwistAmp®exo反应中，聚合酶和核酸外切酶III处于竞争关系。随着反应的能量逐渐耗尽，核酸外切酶III开始占据优势，结果导致探针更快速地裂解和荧光信号出现剧增。

可以保存TwistAmp®   反应产生的扩增子吗？

可以，TwistAmp® Basic 或nfo 反应体系的扩增子短期可以保存在4°C 下，长期保存在-20°C  下。

TwistAmp®exo(RT)反应的扩增子不能保存。如果在反应停止后未经迅速的失活处理，核酸外切酶III很可能会消化扩增子。